WB 滤纸产品组合

在WB 实验转印过程中，膜和滤纸都是一个非常重要的载体。别看他们只是一张纸，可是对于整个实验也是有着举足轻重的关键作用！那么对于各种蛋白，要怎么选择转印方法呢？滤纸和膜，又需要怎么选择呢？（关于膜的选择，请移步：WB转印膜产品组合）

对于大分子量蛋白，建议采用湿转，但是转印速度较慢并需要大量的缓冲液。为了得到清晰、尖锐的条带，获取高质量的转印效果，优先选择湿转，次选半干法转印。在湿转过程中，大量缓冲液会升温，温度升高会导致蛋白质不可逆地变性。因此，使用冷却缓冲液并保持低温非常重要， 许多商品化湿传系统可连接到恒温循环水浴。另一个常见的过程是在4°C环境下进行整个湿转实验，比如在冰箱中。

♦ 进行电转时，确保在将凝胶涂敷到膜上时不形成气泡。气泡会导致膜上没有蛋白质转移的空白点。
♦ 可使用预冷的转印缓冲液，可避免转印中系统过热。
♦ 如果无法确认组装三明治或连接电源是否正确，请预先在凝胶两侧放一张膜，避免丢失蛋白。彩色marker将帮助您确定蛋白转移至哪张膜上！小分子蛋白可穿透转印膜，因此可同时使用两张膜转印小分子蛋白。

转印缓冲液及转印条件

转印缓冲液作为导电介质，其中蛋白质是可溶的，它不应影响蛋白质与膜的结合。取决于缓冲液的pH，蛋白转移可以朝向阴极(-)或朝向阳极(+)。此外，分子与膜的结合力受缓冲液特性(如盐类型和浓度)、甲醇浓度以及洗涤剂(如SDS)存在的影响。

♦ 如果转印缓冲液和电泳缓冲液不同，则凝胶在转印之前应放入转印缓冲液中进行平衡，以确保凝胶接触膜之前发生任何膨胀或收缩。该步骤的省略可能导致条带变形或条带分辨率降低。 大多数转印缓冲液中含有甲醇。为了实现蛋白分子与膜，尤其是硝化纤维素膜(6)的有效结合，甲醇的加入是必要的。去除可与蛋白质结合的SDS，可提高分子与膜的结合力。然而，甲醇可能造成凝胶收缩，进而导致蛋白质洗脱率降低。这种效应在大分子量蛋白的转移中更为明显。因此，对于大分子蛋白的转移，建议使用低浓度的甲醇并在转印之前进行较长时间的平衡。

♦ 长期储存后，含有甲醇的缓冲液会变质——在转印之前加入甲醇。

♦ 应选用分析级甲醇，低级甲醇含有金属污染物，污染物将会沉积在电极上。 SDS对蛋白质与膜的结合是不利的，通过平衡15至30分钟，所有剩余的SDS应该在转印之前从凝胶中除去。然而，如果大分子蛋白难溶，或含有过量的疏水性氨基酸，那么需要在转印缓冲液中加入少量的SDS(0.02%至0.1%)。

♦ 如果样品洗脱速率缓慢，则需要较长的转印时间。如果蛋白结合不充分，可尝试不同的缓冲液。   乙醇可以代替甲醇，且更环保。 最广泛使用的蛋白转印缓冲液是经典的Towbin缓冲液。（192mM甘氨酸，25mMTris，20%甲醇[V/V]）。
Towbin和Laemmli缓冲液的pH值通常为8.3左右，不应该用酸或碱来调节。这将导致导电性问题，这会严重破坏实验及损坏设备。

针对大分子蛋白 (分子量> 10kDa)

♦ 配胶时使用低浓度丙烯Xian An

从凝胶到膜的蛋白转移可以放缓，如同跑胶时蛋白缓慢迁移。如果转印大分子蛋白，电泳胶需降低聚丙烯Xian 浓度。低密度凝胶很脆弱，须小心处理。

♦ 多一点SDS，少一点甲醇

大分子蛋白质会沉淀在胶中，提高转印难度。将最终浓度0.1%的SDS添加到转印缓冲液中，将有效避免上述情况。此外，甲醇削弱了SDS与蛋白质之间的相互作用，因此将甲醇减少到10%或更少，将减少蛋白沉淀的风险。

♦ 选择湿转

...并且降低转印速度，通过降低电压或电流，增长转印时间。此外，在4°C进行转印有助于缓解产热的影响， 例如凝胶变形。

针对小分子蛋白 (分子量< 10kDa )

♦ 转印缓冲液中不加SDS

           SDS阻碍了小分子蛋白与膜的结合

♦ 甲醇浓度控制在20%  

         可去除SDS，并提高转印效率

监测并优化转印方法

上述湿转和半干转的标准方法适用于大多数转印实验，如果转印中出现问题，可尝试以下步骤：

♦ 转印缓冲液中加入0.1%的SDS以增强大分子蛋白的溶解度，加入20%的甲醇以增强膜的结合力。

♦ 分两阶段进行转印（仅用于湿转）。在低电流(1mA/cm2)下转印1小时，从而帮助蛋白在膜上的停留时间更长， 可以改善小分子蛋白的结合。为了转移较大分子蛋白，再加第二阶段的较高电流（3.5至7.5mA/cm2）。

♦ 转印后对凝胶进行染色，验证所有蛋白是否完全洗脱。通过预染marker监测到转膜效率。此外，可使用丽春红等可逆染色剂对膜染色进行验证。

♦ 在凝胶的阴极(-)方向放置一张转印膜，以检测组蛋白、核蛋白等带正电的蛋白。此方法需变性胶在无SDS的缓冲液中增加平衡时间，或使用非变性胶，方法仅适用于转膜蛋白的等电点高于缓冲液的pH的情况下。

♦ 放两张转印膜以捕获穿过第一张膜的小分子蛋白 现提供 Cytiva GB005 滤纸和 3MM 滤纸试用，有需要的同学可以联系 Cytiva 店铺申请试用。


滤纸选购指南如下：

		转印滤纸选择指南
品名	3MM 纸	17Chr 纸	GB003 纸	GB005 纸
厚度	0.34mm	0.92mm	0.8mm	1.5mm
毛细流速	130mm/30min	190mm/30min	略	略
吸水量	185mg/cm2, 适 中	高	较大	极大
推荐应用	全球标准纸用与电泳杂交	半干转印	普通凝胶转印	半干转印
成像方式		荧光或化学发光胶片或CCD成像仪

订购货号：

Whatman 3MM 印迹滤纸

3030-866	3MM 滤纸 8*10 英寸	100 张
3030-704	3MM 滤纸 27cm*100m	1 卷
3030-681	3MM 滤纸 15cm*100m	1 卷
3030-675	3MM 滤纸 12.5cm*100m	1 卷
3030-861	3MM 滤纸 20*20cm	100 张
3030-917	3MM 滤纸 46*57cm	100 张
3030-153	3MM 滤纸 15*17.5cm	100 张
3030-6461	3MM 滤纸 26*41cm	100 张
3030-6185	3MM 滤纸 11*14cm	100 张
3030-221	3MM 滤纸 18*34cm	100 张
3030-6132	3MM 滤纸 12*14cm	100 张
3030-6189	3MM 滤纸 4*5.25 英寸	100 张

Whatman 17Chr 印迹滤纸

3017-915	17Chr 滤纸 46*57cm	100 张
Whatman GB 印迹滤纸
10426981	GB005 滤纸 200*200mm	25 张
10427818	GB003 滤纸 200*200mm	100 张
10427813	GB003 滤纸 160*180mm	100 张
10427812	GB003 滤纸 150*200mm	100 张

•  Amersham“ 三明治 ” 印迹膜 / 滤纸组合，每组含 1 张印迹膜与 2 张 3MM 印迹滤纸
 

10600122	PVDF 0.2μm/3MM 80*90mm	10 张
10600121	PVDF 0.45μm/3MM 80*90mm	10 张
10600110	PVDF 0.45μm/3MM 140*160mm	10 张
10600116	PT 0.1μm/3MM 80*90mm	10 张