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- 详细信息
- 用户评价
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-25~-15℃保存1年，18个月内不影响使用。
- 英文名：
pClone007 Blunt Simple Vector Kit
- 库存：
充足
- 供应商：
北京擎科生物科技股份有限公司
- 规格：
20次
1分钟快速连接，平末端的PCR产物适用，无多克隆位点
本产品利用拓扑异构酶Ⅰ（Vaccinia topoisomerase Ⅰ ）瞬间完成连接反应的优良特性，结合本公司独特的载体制备工艺，完美解决传统TA克隆的各种缺陷，实现克隆技术的革命飞跃。
5分钟快速连接
低背景，阳性率可达95%；
无多克隆位点，连接300 bp以下的小片段可避免测序中断；
无需蓝白斑筛选。
【产品应用】
本产品适用于≤5,000 bp目的片段的平末端克隆。
【产品组成及保存】
-25~-15℃保存1年。
| 组分 | 规格（20 次） |
| pClone007 Blunt Simple Vector(15 ng/μL) | 20 µL |
| 10×Topo Mix | 20 µL |
| Super PCR Mix（Green）* | 500 µL |
| Control Template（50 ng/µL）** | 10 µL |
| pUC19（10 pg/µL）*** | 10 µL |
**阳性对照片段，用于检测目的产物的质量，大小为1 kb。
***阳性对照质粒，用于检测感受态细胞的质量，为Amp抗性
【操作流程】
| 插入片段大小 bp | 最佳用量 ng |
| 300~1000 | 10~50 |
| 1000~2000 | 50~100 |
| 2000~5000 | 100~200 |
【问题讨论】
Q1.克隆数少或者不长克隆?
1）连接体系放冰上或冰箱中，加入感受态时没有立即混匀
低温会显著降低 Topo 酶连接效率，连接反应结束后及时转化，不能置于冰上或冰箱中；加入感受态时迅速吹打搅拌混匀，以上两点操作可以有效提高克隆数。
2）感受态效率低
推荐TreliefTM5αChemically Competent Cell（目录号∶TSC-CO1），转化效率可达1.5×1010 cfu/μg。
自制钙转感受态与本产品兼容性不佳，转化效率仅107cfu/g;感受态保存不当，如放置于-20℃或反复冻融会进一步降低转化效率。
3）感受态细胞中加入过多的连接产物
连接产物的体积不宜超过感受态细胞体积的1/10，否则会显著降低转化效率。
4）回收产物不纯
不推荐多管样品过一个柱子的方式回收DNA，会造成更多的EDTA、肌盐等杂质残留，抑制反应；胶回收产物请勿使用TE进行保存。
5）出现连接抑制效应
用于连接的DNA浓度太高时，会降低连接效率。请严格参照说明书确定DNA的加入量。
6） 反应体系未混匀
推荐将所有溶液直接加入管底后用移液器吸打混匀。低速离心或手甩的方式不足以混匀反应体系。
【实例分享】
使用007连接2 kb PCR扩增产物后转化Trelief ™ 5α Chemically Competent Cell。菌落PCR鉴定阳性率16/16，测序正确率100%。
本试剂产品仅供科学研究或进一步生产使用,不可用于临床诊断或治疗。
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用户评价
暂无用户评价
文献和实验商品化的T载体有很多。本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。 【试剂与器材】
片段回收纯化。 2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体 是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。 商品化的T载体 有很多。本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆
polymerases possess 3´→5´ exonuclease activity that removes the 3´-A overhangs necessary for TA Cloning® and TOPO TA Cloning®. A simple procedure to add 3´ adenines to blunt-end fragments is provided below. Other protocols may be suitable
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