- ￥1200
- 擎科生物
- 武汉
- TSE301
- 2026年01月02日
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- 技术资料
- 保存条件：
-25~-15℃避光保存，避免反复冻融。
- 英文名：
2×T5 Fast qPCR Mix（Probe）
- 库存：
充足
- 供应商：
北京擎科生物科技股份有限公司
- 规格：
5×1.0 mL
2×T5 Fast qPCR Mix（Probe）
快速耐脏型探针法专用qPCR试剂
【产品特点】
抗体修饰的热启动酶，灵敏度高、特异性强、稳定性好；
特别优化的反应缓冲液，重复性好，可信度高；
配有适合不同机型的ROX Reference Dye。
【产品简介】
本产品是采用探针法进行Real Time PCR的专用试剂，可对目的片段进行快速、高特异性的定量检测。产品中包含经抗体修饰的热启动DNA聚合酶及特别优化的反应缓冲液系统，显著提高了扩增的特异性和灵敏度，可在较宽的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确地定量与检测。配套的ROX Reference Dye I/II可用于校正仪器孔间误差。本产品为浓度2×的预混液，使用时只需添加模板、引物、探针和ddH2O，使Mix工作浓度为1×即可。
【产品组成及保存】
-25~-15℃避光保存，避免反复冻融。
| 组分 | 规格 |
| 2×T5 Fast qPCR Mix（Probe） | 5×1 mL |
| 50×ROX Reference Dye I（High） | 200 µL |
| 50×ROX Reference Dye II（Low） | 200 µL |
【操作流程】
1.在PCR管中配制如下反应液，混匀短暂离心后，上机反应。
| 20 µL | |
| 2×T5 Fast qPCR Mix（Probe） | 10 µL |
| 10 µM Primer F | 0.8 µL |
| 10 µM Primer R | 0.8 µL |
| 10 µM Probe* | * |
| 50×ROX Reference Dye I/II** | 0.4 µL |
| Template DNA/cDNA | *** |
| ddH2O | Up to 20 µL |
**根据不同仪器类型选择ROX
**如果模板为DNA，建议用量不超过100 ng，如果模板为cDNA，建议用量不超过总反应体系的1/10，根据稀释梯度结果确定用量。
2.推荐如下qPCR反应程序 (两步法)
| 温度 | 时间 | 循环次数 | 采集荧光 | ||
| 1 | 预变性 | 95 ℃ | 2~5 min* | 1 cycle | / |
| 2 | 循环反应 | 95 ℃ | 10 s | 40 cycles | / |
| 60 ℃ | 20-50 s** | 采集 |
**使用两种或以上的探针，反应时间可以增加至50 s。
【问题讨论】
Q1：使用探针法进行荧光定量，该如何选择探针？
A1：选择报告荧光基团时首先要确认激发波长和发射波长与仪器匹配。对于多重荧光反应，标记不同探针的报告基团染料的最大发射波长应该至少有15 nm的差异。
对于淬灭荧光基团，必须保证其吸收光谱与报告基团的发射光谱有重合。
尽量不要选择TAMRA作为淬灭基团。因为TAMRA本身就是个荧光基团，虽然它也有淬灭作用，但也会加强本底荧光强度。
| 淬灭基团种类以及使用的报告基团种类的选择 | |||||||||
| 淬灭基团种类 | 淬灭基团性质 | 使用的报告基团种类 | |||||||
| TAMRA | 荧光物质 | AM、HEX、TET、JOE 等 | |||||||
BHQ 系列染料 |
BHQ1 | 非荧光物质 | AM、HEX、TET、JOE 等 | ||||||
| BHQ2 | 非荧光物质 | Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、Cy5 等 | |||||||
| BHQ3 | 非荧光物质 | Cy5 等 | |||||||
| 荧光基团与淬灭基团的适配建议 | |||||||||
荧光基团 |
最大激发波长 |
最大发射波长 |
可选择的淬灭基团 | ||||||
| BHQ1 | BHQ2 | BHQ3 | DABCYL | TAMRA | |||||
| 480-580(535) | 550-650(579) | 620-730(672) | 380-550(453) | 470-560(544) | |||||
| FAM | 494 nm | 荧光物质 | ✓ | ✓ | |||||
| TET | 521 nm | 非荧光物质 | ✓ | ✓ | ✓ | ||||
| JOE | 520 nm | 非荧光物质 | ✓ | ✓ | ✓ | ||||
| HEX | 535 nm | 非荧光物质 | ✓ | ✓ | ✓ | ||||
| VIC | 538 nm | ✓ | ✓ | ✓ | |||||
| CY3 | 552 nm | ✓ | ✓ | ✓ | |||||
| TAMRA | 560 nm | ✓ | |||||||
| ROX | 587 nm | ✓ | |||||||
| CY5 | 649 nm | ✓ | ✓ | ||||||
Q2：如何设计一条好的探针？
A2：
长度和位置：探针长度通常在20-30 bp，确保达到好的猝灭效果。探针5’应尽可能靠近上游引物3'，但不要重叠，以确保Taq DNA聚合酶快速切割降解。
序列：避免连续的单碱基重复序列，尤其是G，这可能会影响探针的二级结构，并降低杂交效率。特别是探针的5'端的第一个碱基不能为G，它能淬灭荧光。比如即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。探针内部或探针与两条引物之间避免3个碱基以上的互补序列。
熔解温度：Taqman探针的Tm要比引物Tm高约10℃，通常在65~70℃，以确保探针与模板结合的稳定程度大于引物与模板结合的稳定程度，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。新型Taqman MGB探针通过在探针上共轭一个MGB基团可以使探针Tm提高10℃，使得探针长度只需要13~20 bp，其特异性和灵敏性都更高，常用于SNP分型。
保守性：探针序列要求绝对保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不同的碱基最好不要在两端，不利于探针的杂交。且最好为A或T，而不能为G或C。
BLAST检索确认探针特异性。为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在BLAST中核实一次，若发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
Q3：探针法qPCR出现直线型扩增曲线是什么原因？
A3：探针部分降解会导致直线型扩增。一般稀释的探针可在4°C保存至少3个月，探针的反复冻融会导致降解；探针在光线下暴露时间太长也会引起降解。反应液中有PCR抑制物也会导致直线型扩增。
【实例分享】
完美精准分型
以不同人类基因组gDNA样本为模板，对rs4947963位点进行分型
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文献和实验Real-time qPCR 手册——手把手教你从菜鸟到高手
的LineGene 系列。 随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的 real-time PCR 仪器生产比如西安天隆科技公司的 TL 系列仪器。 二、Real-time qPCR 概述 1. Real-time qPCR 原理 实时 PCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。一般来讲，定量 PCR 仪包括：实时荧光定量 PCR 仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧
一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用
再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。二、Real-time qPCR概述1. Real-time qPCR原理实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。一般来讲，定量PCR仪包括：实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品
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