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- 泽叶生物
- ZY00532D
- 美国
- 2025年07月15日
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1年
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上海泽叶生物科技有限公司
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-20
- 规格：
支
来源：原核表达
宿主：E.coli
规格：10µg 50µg 200µg 1mg 5mg
内毒素水平：<1.0EU/µg(LAL法测定)具体详见说明书
片段与标签：Asp1208~Val1453 with N-terminal His Tag
物种来源（人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猕猴、山羊、绵羊、马、牛、猪、鸡、狗等其他物种多物种）相同的名称，不同的物种。
性状：冻干粉
表达系统： 大肠杆菌
产品纯度：>95%-98%（SDS-PAGE & RP-HPLC）
保存条件：如果样品在2-4周内使用，可以在4°C低温储存。
重组蛋白有几个疑点：
1、表达量如何？
2、超声过程中注意冰水浴了吗？
3、“蛋白条带由1条变成3条”是不是说表达后的全菌电泳目标蛋白是一条带，而在超声或溶菌酶处理后这1条带降解成了3条？
4、降解成的3条带中还有原来的融合蛋白条带吗，量如何？
5、变性纯化后的纯度如何？
6、能否把相关电泳图发上来看看？
答：蛋白表达量不高，但也不低；
超声过程一直是在冰上进行的；
全菌电泳目的蛋白是一条带；
降解成3条带后，大部分情况下是有目的融合蛋白的，量比较少；
变性纯化后纯度还是挺不错的。
重组蛋白两个建议：
1、用非变性纯化样品去做EK酶切、纯化。
如果融合蛋白的降解是从N端开始的，而C端没有降解，那么应该能够拿到38肽。
我曾经有个这么个类似情况，酶切后证实是N端降解，C端的目的蛋白好好的，大小都对。
做EK酶切多了，往往会发现，PET32a的融合段硫氧还蛋白加histag部分确实易被进一步酶切水解。但Ni柱的结合特性不变，说明水解是从N端开始的。
先做酶切梯度，电泳确定酶量标准。不要用酶说明书的量，有时候差距非常大。和蛋白种类相关。
酶切后的纯化方法首Ni柱穿透纯化，可能要加少许咪唑及盐，以利用酶切后的目标蛋白不吸附Ni柱。
2、用变性纯化的样品做复性处理
重组蛋白变性纯化的样品纯度不错，查阅一下有关的复性方法资料，设计一个方案。
你用超滤和透析的方法都失败了，可以考虑用稀释的方法，控制终蛋白浓度小于0.1mg/ml，蠕动泵滴入搅拌的稀释液中，pH控制高的，如pH9-10，适当加一些甘油和EDTA，DTT。
影响蛋白原核表达的因素很多，如蛋白的亲水性、密码子的稀有性、蛋白毒性等。如疏水性过强，就难以表达；稀有密码子过多或多个稀有密码子连在一起也难以表达。我以前也遇到过这种情况，首先要分析你的蛋白序列和二级结构，看看是否存在这些影响因素。如果必须要表达全长蛋白，像你这种情况难度就比较大，可以进行密码子的改造，或者更换载体，或者更换宿主菌。看你试验的目的，如果不需要表达全长蛋白，如表达部分抗原性强的片段，可以简单一点，表达部分片段即可。
重组蛋白表达出来的蛋白比实际大小要小，这是为什么？
主要原因有如下几个方面
1. 蛋白本身被降解了，可以存在一些不利于该蛋白稳定的蛋白酶
2. 翻译起始位点的问题：如果一个类似于核糖体结合位点(AAGGAGG)的序列加上适当的间隔序列出现在了ATG密码子上游，降解就会有可能出现。解决的方法可以采用两端都带有融合标签的载体，例如pET系列部分载体在N-端和C-端都有His-Tag融合标签。这样，全长蛋白就可以通过提高咪唑浓度，在洗脱时将截短蛋白与全长蛋白区分开。或者在蛋白两端采用不同标签，进而通过亲和纯化的方式得到全长蛋白。
3. 影响蛋白稳定性的另外一个因素是与N端Met相邻的氨基酸，即N端原则，当下列氨基酸出现在N端时: Arg、 Lys、Phe、Leu、Trp和Tyr 蛋白的半衰期较短，蛋白会存在不稳定降解的问题，特别是Leu，当它出现在第二个位置上时，蛋白极度不稳定。在选择克隆位点时， Nco I 和Nde I都是 是一个比较好的N端的克隆位点选择，而使用NdeI的时候就要特别留意Leu的出现。
重组蛋白如何提高蛋白的可溶性表达比例及表达量？
有些蛋白质表达水平低，或者表达的大多是包涵体，通常情况下通过基因优化，载体及菌株的筛选，表达条件优化，诱导条件优化等可以有效增加蛋白的可溶性比率及表达量。
1. 密码子优化
密码子优化是根据大肠对密码子的偏好性进行优化筛选，一般选择使用频率大于20%的密码子。经过优化的基因序列能提高mRNA二级结构的稳定性，避免因为不充足的tRNA库导致翻译延迟，成熟前翻译终止，翻译移码和氨基酸错配。
2. 降低蛋白表达速率
通过降低IPTG的诱导浓度，降低蛋白的表达速率。通过调节促使肽链聚集的速率与其折叠速率平衡，有利于提高蛋白的可溶性表达。
3. 温度
37度的表达条件往往会使一些蛋白形成包涵体，而30度的表达条件则可能产生可溶的或者有活性的蛋白。在某些条件下（12-20度）延长诱导时间（过夜）会使溶解性蛋白的产量达到最大。
4. 细胞周质表达
我们可以选用一些将蛋白运输到细胞周质的载体。周质空间更有利于蛋白的正确折叠及二硫键的形成。常规选用的载体有pet22系列。但是我们要注意的是，有些蛋白并不适合于被运输到周质空间，比如一些与β-gal融合的周质的内部被证明是有毒的。
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