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- 2025年07月09日
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40
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详见说明书
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详见说明书
- 供应商：
上海西格
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低温冷藏
- 规格：
50次
| 产品名称 | DNA电泳分子量标准系列 |
| 规格 | 50次 |
| 货号 | XGR16940 |
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
DNA电泳分子量标准系列视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2：调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，在72℃ 保温7min。
3：结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4：PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
PCR反应鉴定——PCR反应条件:
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 94℃ | 5 min | 1 |
| 变性 | 94℃ | 10 sec | 30-40 |
| 退火 | 50-65℃ | 20 sec | 30-40 |
| 延伸 | 72℃ | 30 sec/kb | 30-40 |
| 终延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
典型的PCR由
（1）高温变性模板；
（2）引物与模板退火；
（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：
将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；
人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；
耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
操作步骤 :
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1（10pM） 2μl
引物2（10PM） 2μl
Taq酶（2U/μl） 1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
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荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：
(1)将参照基因与待测目的基因片段等比例连接，克隆到同一个质粒载体上，构建一种可同时用于参照基因以及待测目的基因扩增检测的标准品，并将所得标准品按照浓度梯度稀释后同时用于绘制参照基因以及待测目的基因的标准曲线；
(2)待测样本与步骤(1)所述标准品经同步进行实时荧光定量PCR扩增后，目的基因与参照基因按照各自的标准曲线计算各自的拷贝数，计算待测样本的目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的拷贝数相对定量检测结果。
其中步骤(1)为：将参照基因与待测目的基因片段等比例连接，克隆到同一个质粒载体上，构建一种可同时用于参照基因以及待测目的基因扩增检测的标准品，并将所得标准品按照浓度梯度稀释后同时用于绘制参照基因以及待测目的基因的标准曲线。
其中所述参照基因为本领域常规参照基因，较佳地管家基因，优选地为RPPH1的扩增区域，其中所述质粒载体为本领域常规质粒载体，较佳地为PCR克隆载体，优选地为TA cloning载体，所述TA cloning载体较佳地为pMD18-T载体。其中所述标准品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例较佳地为1：1。由于标准品中待测目的基因与参照基因的比例为1:1，解决了目前相对标准曲线法应用中目的基因与参照基因的浓度比例关系难以控制的问题，提高HER2基因扩增检测的可靠性。
步骤(2)为：待测样本与步(1)所述标准品经同步进行实时荧光定量PCR扩增后，目的基因与参照基因按照各自的标准曲线计算各自的拷贝数，计算待测样本的目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的拷贝数相对定量检测结果。
其中所述待测目的基因为本领域常规待测目的基因，较佳地为肿瘤或者疾病的特异性基因，更佳地为HER2基因的扩增区域，所述荧光定量PCR扩增为本领域常规荧光定量PCR扩增方法，所述荧光定量PCR扩增方法较佳地为多通道荧光定量PCR扩增，更佳地为双通道荧光定量PCR扩增。
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文献和实验相关实验
以λ/Hind III为代表的λDNA酶切片段用作电泳分析中的分子量标准，会发现电泳后分子量条带不对的问题。 解释原因如下：在Lambda DNA分子的左右臂存在着12个碱基组成的具有互补顺序的单链突出端-COS位点，COS位点的退火复性，在λDNA片段电泳分离时会出现问题，含左右臂片段在胶上应出现的地方条带会减弱或完全看不到，而复性的左右臂片段会结合成大的片段，即在较大的分子量区域内产生一个额外的条带，这就造成了不正常的带型。 解决以上问题的办法
2. 次优样品分离。(A) 负载影响条带分辨率。 (B) 上样量过低会导致条带扭曲。 在上样缓冲液中准备好样品和分子量标准，其最终的体积通常占胶孔体积的 30%。由于孔底分布不均匀(图 2B)，使用较少的上样体积会导致条带扭曲。对于含有 DNA 结合蛋白或粘性末端的样品，凝胶上样之前，混合物需加入至 含有 SDS 的上样染料中一同加热，因为蛋白质结合以及 DNA 片段之间的相互作用会导致分离效果不佳。 c .上样染料和缓冲液选择 制备凝胶电泳时，样品中添加了凝胶上样缓冲液 (通常是 6X 或 10
S rRNA 的电泳和分析评估纯化的 RNA 的两个样品的完整性。（C）在凝胶上测定 DNA 片段化的效率和片段化 DNA 的分布。（M=分子量标准品。RNA 样品在变性凝胶上运行。） d. 检测混合样品中的目标序列 凝胶电泳是通过探针杂交检测核酸库中的靶序列的工作流程的关键部分（图 5，图 6）。其中，探针指的是具有已知序列的单链核酸，专用于通过碱基互补与目标序列结合。 对于 DNA 片段分析，Southern 印迹法和限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）分析是两种众所周知的技术，其中使用电泳
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