RT-抗亚碲酸盐大肠杆菌（大肠埃希氏菌）157:7型探针法荧

RT-抗亚碲酸盐大肠杆菌（大肠埃希氏菌）157:7型探针法荧光定量PCR试剂盒需要自备的器材：
1．仪器：分析天平、离心机、荧光 PCR 扩增仪、组织研磨器、-20 ℃冰箱、可调移液器（2 µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：荧光 PCR 专用反应管、眼科剪、眼科镊、生理盐水、1.5 mL 经焦碳酸二乙酯（DEPC）水 处理的灭菌离心管、吸头（10 µL、200 µL、1000 µL）、灭菌双蒸水。

人鼻咽癌癌基因多肽抗原    进口/国产    英文名称：    LPLUNC1
淋巴管内皮透明质酸受体抗原    进口/国产    英文名称：    LYVE-1(lymphalic vessel endotheilial hyaluronan receptor 1)
血管紧张素转换酶(抗原)    进口/国产    英文名称：    ACE( ACE, testis-specific isoform precursor)
整合素alpha E2抗原    进口/国产    英文名称：    Integrin alpha E2 peptide
巨噬细胞表面分子抗原    进口/国产    英文名称：    Mac-1 (Mac-1/CR3/CD11b+CD18)
v-maf 肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A抗原    进口/国产    英文名称：    Mafa(avian)(V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A)
黑色素瘤相关    进口/国产    英文名称：    MAGE-1
丝裂原活化蛋白激酶激酶1抗原    进口/国产    英文名称：    MAPKK1 (MAP kinase kinase 1)
细胞凋亡信号调节激酶1/丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶5抗原    进口/国产    英文名称：    ASK1/MAPKKK5
抑癌基因抗原    进口/国产    英文名称：    Maspin (mammary serine protease inhibitor)
蛋白裂解酶（一种新的癌基因）抗原    进口/国产    英文名称：    Matriptase
人巨细胞病毒UL49抗原    进口/国产    英文名称：    HCMV UL49(Human Cytomegalovirus UL49 Gene)
黑皮质素-1受体抗原    进口/国产    英文名称：    MC-1R (melanocortin-1-receptor)
髓样细胞白血病-1抗原    进口/国产    英文名称：    Mcl-1(myeloid cell leukemia 1) peptide
多药耐药蛋白抗原    进口/国产    英文名称：    MDR1(multidrug resistance 1)
肌细胞增强因子2抗原    进口/国产    英文名称：    MEF2(myocyte enhancer-binding factor 2)
线粒体融合蛋白1    进口/国产    英文名称：    Mfn1 (Mitofusin1)
金属硫蛋白抗原    进口/国产    英文名称：    MT(metallothionein)
层粘连蛋白受体1抗体    进口/国产    英文名称：    MGr1-Ag/37LRP(P37-kDa laminin receptor precursor)
层粘连蛋白受体1抗原（C端）    进口/国产    英文名称：    MGr1-Ag/37LRP(P37-kDa laminin receptor precursor)(CT)
RT-抗亚碲酸盐大肠杆菌（大肠埃希氏菌）157:7型探针法荧光定量PCR试剂盒特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板，操作简单，定量准确快速。
2. 引物经过优化，特异性强。预期的 PCR 产物长度为 560 bp。
3. PCR mix 中含上样染料，PCR 后可以直接上样电泳。
4. 提供阳性对照，便于分析试验结果。
使用方法：
注：所有试剂使用前需完全解冻，混合均匀，6,000rpm离心数秒后使用。
1. 样本处理（样本处理区）
待检样本的核酸提取可采用病毒RNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪等，具体提取方法请参照相关说明书；阳性质控品及阴性质控品无需提取，可直接使用。
2. 扩增试剂准备（PCR前准备区）
取N个（N=阴性质控品+待检样本+阳性质控品）PCR反应管，每管分别加入FMD RT-PCR反应液19μl、RT-PCR酶1 μl (也可根据每头份用量计算N+1份FMD RT-PCR反应液、RT-PCR酶所需总量，两者混匀离心后分装20 μl至单个PCR反应管)。
组分每头份用量FMD  RT-PCR反应液19 μlRT-PCR酶。
1 .将所有PCR反应管于6,000rpm离心30s，转移至样本处理区。 2.加样（样本处理区） 3.在上述的PCR反应管中分别加入待检样本RNA提取物、阴性质控品和阳性质控品各5 μl，盖紧管盖，于6,000rpm离心10s，转移至扩增区。

反应五要素：
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。