大豆原生质体制备及转化试剂盒

大豆原生质体制备及转化试剂盒
产品简介：

  本试剂盒主要通过纤维素酶和离析酶溶液消化植物细胞壁获得原生质体。适用于从7~12天的大豆幼苗中分离原生质体。获得的原生质体可用于蛋白的亚细胞定位，验证蛋白间的相互作用，研究蛋白的转录调控等。

  本试剂盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂，按照每次20mL酶解液的使用量，可供5次（5T）/10次（10T）实验。

使用说明：

一、准备工作

1. 需要准备的材料（本试剂盒不提供）：

锋利刀片；血球计数板；50mL离心管；2mL离心管。

2.即用型酶解液配制

 

 二、原生质体的分离制备

1. 在28℃的黑暗环境中培养7~12天大豆黄化苗，至大豆幼苗第一片真叶完全展开。以真叶完全展开后4天的大豆的叶片作为大豆原生质体细胞制备的材料。

2. 将1g新鲜的大豆组织材料（样品量可适当增加）用锋利的刀片将材料切成大小约0.5mm宽的细条。置于含有20mL酶解液的三角瓶内，于黑暗条件下100rmp/min，28℃震荡酶解10h。

3. 酶解后的产物用细胞筛过滤，用镊子或无菌枪头轻轻搅拌，充分释放原生质体，去除未消化的叶片组织。用10mL预冷的溶液II-W5 solution冲洗酶解器皿和未消化的叶片2~3次，将所有的液体收集到50mL离心管中。

注：操作过程中动作尽可能轻柔，避免剧烈震荡，防止原生质体破碎。

4. 选用水平转头，100g离心10min，升速3，降速3，去除上清。  

注：去除液体时最好用移液枪，避免直接倒。离心时，可调低离心机的升速和降速。升速过快，原生质体可能离到管壁上；降速过快，可能导致管底原生质体悬起。建议升速和降速分别都使用3。

5. 加入10mL预冷的溶液II-W5 solution，用蓝枪头（剪掉尖端）轻轻悬起原生质体，100g离心10min，升速3，降速3，去上清。

6. 加入1mL预冷的溶液II-W5 solution，用蓝枪头（剪掉尖端）轻轻悬起原生质体，转移至2mL圆底离心管，冰上静置30min。

7. 显微镜下观察原生质体状态并计数。

注：原生质体呈现圆球形，叶绿体分散在整个细胞内，说明状态较好；如呈现不规则形状，说明原生质体破碎或即将破碎。如果细胞量较少（少于2×105个/mL），可以将所有细胞用于1~2个转化体系。

8. 100g离心10min，升速3，降速3，去上清，用相应体积的溶液III-MMg solution溶液重悬原生质体，使原生质体浓度为8.2×105个/mL。

血球计数板的使用：
  如下图所示，在血球计数板上加上一个盖玻片，分别从两侧凹槽加入样品。使用中央区域长和宽都是1 mm的方形区域进行计数（25个中方格）。分别统计正方形四个顶角和中央的小正方形的细胞数量，取平均值再乘以25（正方形被分成了25个小正方形），计算该区域的细胞数量，该区域的体积为0.1 µL（长1mm，宽1 mm，高0.1mm）。计算获得的细胞数量。原生质体浓度（个/mL）=25个中方格原生质体数×104×稀释倍数。

 

三、原生质体的转化

1. 在2mL的圆底离心管中加入20µL（10~20 µg）纯化后的质粒，随后加入200µL已调整好浓度的原生质体，轻轻混匀，再加入220µL的溶液IV-PEG solution，轻柔旋转离心管，使用蓝枪头（尖端剪掉）轻轻吸打，直至混匀，此过程应避免产生气泡，28 ℃弱光培养20min，每5min轻柔混匀。

2. 加入0.5mL的溶液II-W5 solution，轻柔混匀，终止转化。常温100g离心10min，升速3，降速3，在不损失原生质体的情况下，尽可能去上清。

3. 加入1mL的溶液II-W5 solution悬浮原生质体，常温100g离心10min，升速3，降速3，去上清。

四、原生质体的培养和收集

1. 加入1mL的溶液V-W5（含BSA）培养液悬浮细胞。将离心管水平放置将离心管水平放置，28 ℃弱光培养16h。

2. 收集细胞时，缓慢将离心管拿起，用枪头将附着在管壁上的细胞轻轻悬起，离心管室温垂直静置几分钟后再离心，100g离心10min，升速3，降速3，去除大部分溶液V-W5（含BSA），收集原生质体，用于后续实验。

注意事项：

1. 分离制备的原生质体没有细胞壁的保护，非常脆弱，整个实验操作过程中动作尽可能的轻柔。

2. 为了避免原生质体离心时贴在管壁，建议整个实验过程使用平角转头。

3. 实验过程中尽可能使用剪尖蓝枪头（1mL吸头），因为其尖端的孔径较大；或把黄色枪头的尖端剪掉，保证平滑。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！