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- 2025年11月11日
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Hanbio汉恒生物
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整体实验服务
一、划痕实验
细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。
实验内容：
材料：6 孔板（其他多孔板亦可，但6孔较好，大小适中）、marker笔、直尺、20微升枪头（灭菌）、无血清培养基、PBS
步骤：所有操作器械都要提前灭菌，直尺和marker笔在操作前用紫外照射30min（超净台内）
1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。
2．在孔中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞大小及特性的不同来设定，掌握为过夜能铺满孔板为宜。
3．第二天用枪头比着直尺进行划痕，直尺尽量垂直于背后的横线，枪头要垂直，不能倾斜。
4．用PBS洗3次，去除划落的细胞，然后加入无血清培养基。
5．放入37度5% CO2培养箱中进行培养。之后按0，6，12，24小时取样，拍照。
注意事项：
1. 一般做划痕实验，都是在无血清或者低血清状态下培养的，否则细胞本身的增殖情况就不能忽略。
2. 按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，这就解决了前后观察时位置不固定的问题。
二、Transwell检测迁移
细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：
1. 材料准备：
可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多/聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）
2. 步骤和流程：
2.1基质胶铺板：
用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液
①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞
①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl含20%PBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
2.4结果统计
直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。
1. 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。
2. 0 .1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。
3. 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。
三、 Transwell检测侵袭
transwell侵袭实验就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，细胞会往高营养的培养液方向移动。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验内容：
（1）共培养体系：
小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。常用0.4、3.0µm。我们实验室用的是0.4µm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。
（2）趋化性实验
可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。
①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。
②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。
（3）肿瘤细胞迁移实验
常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
（4）肿瘤细胞侵袭实验常用8.0、12.0µm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。
在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或实验设定的药物或者影响因子，细胞会分泌相关酶类消化模拟细胞外基质膜的基质胶，从而从上室迁移到下室，通过计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。
实验图片示例：
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文献和实验相关实验
细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。划痕实验大家会做，那么如何将这一大批的图片进行实验距离的测定呢？Image J 又要派上用场了，它不仅可以用于分析 DNA 电泳 WB 条带的灰度值、细胞计数、细胞共定位，就连细胞划痕面积一样可以计算！一、划痕实验的实验原理和步骤先简单的回顾下划痕实验的实验原理和实验步骤。1. 实验原理细胞划痕法是测定肿瘤细胞的运动特性的方法之一，是在体外培养的单层细胞上划痕致伤，观察肿瘤细胞的迁移
知识。 赛多利斯推出Incucyte®实时活细胞分析系统，可以置于培养箱中直接对细胞进行实时、动态、连续的长时间监测，确保细胞免受干扰，并将细胞的“精彩故事”变成mini电影呈现出来，提供更生动、更有趣的细胞洞察。 目前有超过9400篇相关文献均使用Incucyte®系统进行细胞学研究，其中CNS顶刊超过100篇，广泛涉及肿瘤、免疫、药物开发、代谢、干细胞、再生医学、疾病感染等诸多领域，涵盖了细胞增殖、迁移/划痕/趋化、细胞毒性、凋亡、侵袭、细胞杀伤、3D肿瘤球、神经生长等多种应用。 Incucyte
基本原理：细胞划痕实验（Wound Healing)是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。 划痕实验在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程，是研究细胞迁移的体外试验方法中最简单的方法。 实验方法： 基本的步骤包括“划痕”的制造，细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理。 传统实验方法是使用移液器吸头在单层细胞上手动制造“划痕
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