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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存:
29
- 英文名:
SDS-PAGE loading buffer,4×(with β-Mercaptoethanol)
- 保质期:
详见说明书
- 供应商:
上海博湖
- 保存条件:
-20℃,有效期1年
- 规格:
瓶
| 产品名称 | 4×蛋白上样缓冲液(含巯基还原剂) |
| 英文名称 | SDS-PAGE loading buffer,4×(with β-Mercaptoethanol) |
| 货号 | BH-DB6543 |
英文名称 SDS-PAGE loading buffer,4×(with β-Mercaptoethanol)
储存条件 -20℃,有效期1年
外观(性状) 蓝色粘稠液体
单位 瓶
保存: -20℃,有效期一年。
产品简介:
本产品适用于SDS-PAGE(SDS变性聚凝胶电泳)时作蛋白质上样用。其主要成份为SDS,β-巯基乙醇,溴酚蓝,缓冲盐溶液等。 SDS可与蛋白质结合使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷,这时蛋白质本身的电荷完全被SDS掩盖,消除了各种蛋白质本身电荷的差异,SDS还可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构;β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,消除了蛋白结构之间的差异。最终无电荷及结构上差异的蛋白(亚单位),电泳速度只是与其分子量大小有关;溴酚蓝用作电泳时的指示剂,可大概指示电泳结束的时间。
使用说明:
1. 请按每30μL蛋白样品加入10μL上样缓冲液的比例(4倍稀释)来使用。如果蛋白浓度过高,可用双蒸水稀释样品。
2. 混匀后,100℃水浴加热3-5分钟,使蛋白变性。
3. 冷却到室温后,10000-14000rpm离心2-5分钟,取上清直接上样电泳即可。
注意事项:
1、不同细胞或组织样品所需的固定时间有所不同,应当根据细胞或组织的种类以及组织块的大小来调整固定时间。
2、虽然作用温和,但能硬化组织,固定时间过久会导致组织变脆,切片时易碎。因此固定时间通常不宜超过 24 小时。
3、醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基,使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍。分子间交联形成的网格结构可能部分或 完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露,可造成假阴性的染色,影响免疫组化结果。因此,4%固定的细胞或组织样品在进行免疫组化检测时,有时需要对抗原先进行修复,然后才能进行免疫染色等后续操作。
4、本产品对人体有害,操作时请小心,并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。
5、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作
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操作步骤:
根据使用量,取每 1mL RIPA 加入 10uL PMSF,使 PMSF 的zui终浓度为 1mM。混匀备用(PMSF 现用现加)。
1、样品前处理:
a)对于贴壁细胞:去除培养液,用 PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照 6 孔板每孔细胞量加入150-250 uL 裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。
b)对于悬浮细胞:离心收集细胞,用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞量加入150-250 uL 裂解液的比例加入裂解液,再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必需分装成 50-100 万细胞/管,然后再裂解。
c)对于组织样品: 把组织剪切成细小的碎片。按照每 20mg 组织加入 150-250 uL 裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量)。用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。
2、后处理:
将裂解后的样品 10000-14000g 离心 3-5 分钟,取上清,即可进行后续的蛋白浓度测定、SDS-PAGE、Western blotting 和免疫沉淀等操作。
温馨提示:
工作液与浓缩液选择的技巧,以及各自的优势。
1,工作液的优势:工作液操作方便,降低实验操作步骤,对于要求无菌的实验,降低染菌风险。
2,浓缩液的优势:浓缩液成本相对较低,实验范围更广,对于不要求无菌的实验,可以进行多种浓度的实验分析以及比较。而且由于浓度高,保存更加稳定。
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文献和实验-PAGE 电泳分析检测结果。这种方法得到的目的蛋白 N是在细胞内与蛋白 M 天然结合的,符合体内实际情况,得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 步骤 用预冷的 PBS 溶液洗涤贴壁细胞两次(对于悬浮细胞则用台式离心机以 800-1000 rpm 转速通过离心洗涤)。 加入预冷的 RIPA 液(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂),RIPA 液的用量:按照 0.5 mL 每 5×106 细胞计算。 注:悬浮细胞,收集
入 DMSO 或 2-巯基乙醇,混合后加入 L 连接反应液 (含重组质粒),温和混匀,置冰上 30 min;2. 42 ℃ 水浴 45 秒,然后迅速放回冰中 1~2 min;3. 加入 2 mL LB 培养液,37 ℃ 轻摇荡培养 1 h;4. 4,000×g 离心 10 秒钟,弃上清,用 LB 培养液重悬菌体;5. 将菌液铺于含有适当抗生素的 LB 琼脂培养板上,涂匀,室温放置 20~30 min,倒置于 37 ℃ 孵箱中培养 12~16 h。(三)转化细胞的筛选【实验原理】1、 蓝白筛选:以 TA
它的蛋白溶液可以冻存)与Zwittergent 等双性离子去垢剂; ③还原剂:DTT、DTE、TBP、Tris-base 等;④蛋白酶抑制剂及核酸酶:EDTA、PMSF、蛋白酶抑制剂混合物(Protease inhibitor cocktails)等,如为了去除缓冲液中存在的痕量重金属离子,可在其中加入0.1~5mmol/LEDTA,同时使金属蛋白酶失活。 三、 仪器和试剂 仪器 离心机、移液器、研钵、离心管、冰箱。 试剂 1. 20mL 样品提取缓冲液:2.5mL
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