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- 泽叶生物
- ZY-XJ13-66060
- 中国
- 2025年07月13日
企业认证
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
50
- 英文名：
Trypanosoma equiperdum PCR Kit
- 保质期：
一年
- 供应商：
上海泽叶生物科技有限公司
- 保存条件：
-20℃保存
- 规格：
50次
试剂盒组成：
| 组分 | 规格 |
| 荧光PCR反应液(ESKZ-qPCR MIX) | 672μL |
| DNA抽提液(DNA Extraction ) | 2mL |
| 酶混合物(DNA Polymerase MIX) | 48μL |
| 阴性对照(NTC) | 50μL |
| 阳性对照(ESKZ -PTC) | 50μL |
储存条件：-18℃以下，有效期6个月。
使用方法：
一、样品采集：
1、食品样品：样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照《食品卫生微生物学检验马媾疫锥虫检验(GB/T 4789.40-2008)要求进行。
2、血液样品：用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL，注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管，立即混匀。
3、粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。
4、病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。
DNA提取：
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购上海泽叶生物科技有限公司生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。
1、液体培养物：取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中，8000rpm离心3min，尽量吸弃上清，加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
2、固体培养物：挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
3、粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
4、其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。
三、检测步骤：
1．试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(ESKZ -qPCR MIX)、酶混合物(DNA Polymerase MIX)，室温融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
| 试剂 | 每个反应加入的量 | N个反应加入的量 |
| 荧光PCR反应液 | 14 μL | N×14μL |
| 酶混合物 | 1 μL | N×1 μL |
| 总量 | 15 μL | N×15μL |
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(ESKZ -PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
2．qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件：
| 1循环 | 50℃ for 2 min | |
| 预变性 | 1循环 | 95℃ for 10min |
| PCR扩增 | 40循环 | 95℃ for 15s 60℃ for 60s |
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM
四、结果分析：
1．结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
2．试验成立判定
1）阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。
2）阳性对照(ESKZ -PTC)：均产生扩增曲线，且Ct值≤35。
3）以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
3．结果判定
1）在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明马媾疫锥虫核酸阳性。
2）Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明马媾疫锥虫核酸阴性。
3）如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
4）对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行马媾疫锥虫real time PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明马媾疫锥虫核酸阳性；否则判为样本阴性。
五、注意事项：
1）初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
2）所有使用的离心管应高压灭菌，而且必须不含DNA酶。
3）PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
4）样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
5）试剂盒里所有物品应视为污染物对待，按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
样本采集：
目前大多为呼吸道标本，包括上呼吸道样本（鼻拭子、咽拭子、鼻咽冲洗液）和下呼吸道样本（深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等）。
上呼吸道样本优点是取材容易，尤其是咽拭子在大规模采样的时候容易操作，但是如果咽拭子的样本采集所得的细胞数目过少，可能导致病毒核酸量不够，检测结果出现偏差。
下呼吸道样本一般病毒的拷贝数较高，但临床上一般使用支气管纤维镜进行取材，采集方法比较复杂，对操作者和设备要求高。所以目前样本采集还是以咽拭子为主。
样本保存：
样本采集之后尽快置于2-8℃保存，在72小时内进行检测，如不能及时检测，则需置于-70℃保存。
咽拭子建议直接放在病毒保存液中保存，检测结果显示湿拭子的提取检测效率比干拭子高。
提取的核酸应在-70℃或以下保存，检测之前不要冻融核酸标本超过1次。
生物安全注意事项：
在应对病毒疫情的过程中，作为病毒检测确认的关键技术，核酸检测在其中发挥了极其重要的作用。
PCR病毒的检测包括 “样本采集” “直接或灭活后提取核酸” “扩增检测核酸” 三部分，以上为泽叶生物特别给与的注意事项。
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文献和实验和组织液中。有个别种类如枯氏锥虫则寄生在人的细胞内。 除马媾疫锥虫是通过交媾直接传播外，所有寄生在脊椎动物的锥虫均要依赖某些昆虫（如采采蝇等）进行传播。带有锥虫的脊椎动物血液被媒介动物吸食后，锥虫因生活环境改变，在媒介动物消化道中依次经过无鞭毛体或前鞭毛体上鞭毛体和后循环锥鞭毛体几个不同的发育阶段。在媒介动物中只有这种后循环锥虫对宿主才有感染力。当媒介再次叮咬宿主时，便把后循环锥虫输入宿主体内。伊氏锥虫在媒介消化道中不进行任何发育，它靠媒介在吸血后短时间内作机械传播。锥虫主要通过胞饮
检验技士考试辅导 2011年SLE的实验诊断 （1）抗核抗体 1）免疫荧光法检测抗核抗体：该法以小鼠肝细胞、Hep-2细胞（人喉癌上皮细胞株）、Hela细胞（宫颈癌细胞株）或小鼠腹水癌细胞等作为抗原片，以Hep-2细胞抗原片敏感性较高。 2）抗DNA抗体：分为天然（双链）DNA（ds-DNA）和变性（单链）DNA（ss-DNA）抗体。ds-DNA抗体的测定方法有间接免疫荧光法（以短膜虫或马疫锥虫为抗原
等，还有Hela细胞，大小白鼠的肝和肾冰冻切片（4～6μm）等，以成年小白鼠的肝切片最为常用。用动物细胞核作抗原，可以避免血型的干扰因素。Konice氏等（1978）报告用马疫锥虫（Trypanosoma equiperdum, TE）作抗原测定SLE病人血清中抗双链DNa （dsDNA）因TE的核和动基体为不含蛋白的纯dsDNA，抗原性纯一，特异性强，不需提纯，为天然的dsDNA底物，据认为抗dsDNA抗体为SLE所特有，一些研究指出dsDNA抗体与SLE病情活动及狼疮肾炎的发病机理有密切关系，持续高滴度
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