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24
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详见说明书
- CAS号：
详见说明书
- 保质期：
一年
- 供应商：
上海一研
- 保存条件：
4°C保存
- 规格：
100T/盒
产品名称：STAT3 mRNA原位杂交试剂盒
规格:100T/盒
特异性: 人、大鼠、小鼠、兔
标记方式: 3’—尾段标记
保存条件: 4°C保存一年
试剂盒内容:
1.STAT3寡核苷酸探针杂交液 2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.胃蛋白酶（×10;Pepsin） 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
培养细胞和冰冻切片：
STAT3 mRNA原位杂交试剂盒准备工作：缓冲液的配备
3%柠檬酸——100ml 蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7·H2O)3g,pH2.0 左右。
2×SSC——1000ml 蒸馏水中加氯化钠 17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O，分子量 294)8.8g。
0.5×SSC——300ml 蒸馏水加 100ml 2×SSC 即可。
0.2×SSC——270ml 蒸馏水加 30ml 2×SSC 即可。
20%甘油——20ml 甘油加 80ml 蒸馏水即可。
0.5 M PBS——1000ml 蒸馏水加氯化钠 30g,Na2HPO4·12H2O 6g,NaH2PO4·2H2O 0.4g,PH7.2-7.6。
原位杂交检测步骤：
原位杂交涉及的步骤：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶DNA变性（DNA原位杂交），探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针（显色）检测。
1. 玻片的准备和样品固定
对于染色体涂片，1：1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。
样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中必不可少的步骤，从化学反应角度来看，固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大，因为核酸杂交的功能分子基团被安全地包裹在DNA双螺旋结构中，而交联剂的使用对RNA基本没有影响。对于染色体涂片，常使用甲醇/固定；石蜡包埋的组织切片用福尔马林固定。冷冻切片可通过在4%的中固定30min，或使用Bouin固定剂。
2. 样品预处理
在待测样品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹缠绕，根据不同的细胞和组织样品的应用，可选择合适的预处理方法将靶核酸暴露：
内源性酶灭活：如果探针的检测是通过酶促法进行的，则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的POD可通过含1% H2O2的处理30min。如果检测酶为AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP检测的内源性背景一般来说比POD检测的低得多，因为在杂交过程中，样品中内源性AP酶的活性基本都丧失了。
RNase处理：在DNA-DNA杂交实验中，RNase的处理可去除内源性RNA，增加实验的信噪比。在进行mRNA为靶标的检测时，RNase处理的样品也可作为质控对照。通常的处理方式是将DNase-free的RNase溶解于2×SSC (100μg/ml)，样品在溶液中37℃处理60min。
SSC=150mM NaCl, 15mM 柠檬酸钠溶液(pH7.4)
HCl处理：对样本进行20-30min的200mM HCl处理，可将蛋白抽提，并将核酸序列进行一定程度的水解，增加杂交检测的信噪比。
去垢剂处理：如果对样品的固定、脱水、包埋等预处理过程不足以将脂膜成分破坏暴露核酸，可对样品进行额外的蛋白去垢剂处理(如Triton X-100和SDS)。
蛋白酶处理：样品中待杂交的核酸序列常与蛋白缠绕交联在一起，样品的固定步骤更是加剧了蛋白的交联程度，因此预渗透是核酸杂交前的常规步骤，通常通过蛋白酶K的消化作用来完成。根据不同的文献来源，蛋白酶K的工作浓度通常设为10-500μg/ml(溶解于20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4, 酶浓度可根据具体样品进一步优化)，对样品进行37°C 7.5 –30 min的处理。染色体涂片或核片的蛋白酶K处理浓度可降至1μg/ml消化7.5 min。也有文献指出，福尔马林固定石蜡包埋的组织切片样品，使用胃蛋白酶（500μg/ml，溶于200mM HCl）将得到较好的蛋白消化结果。
对于结缔组织，肝组织等样品，还可进行Collagenase和Dispase的组织消化处理，以降低背景。
3. 探针制备
在进行研究前，确定应用的探针类型。不同探针类型的优劣势请见上文描述。DNA探针的制备包括了前期的DNA片段分离纯化（或cDNA的克隆）和酶促探针标记，可选随机引物标记法和缺口平移法等。RNA探针的制备包括了转录载体克隆和转录法探针标记。寡核苷酸探针的制备要求先获得合成的寡核苷酸片段，再进行末端标记或加尾法探针标记。但无论采用何种标记探针及标记方法，对探针标记效果需进行最终的评估，并准确计算探针浓度。
4. 原位杂交过程
杂交前可进行预杂交，以防止较高的背景染色。预杂交条件与杂交条件相同，只是预杂交液中不含探针和硫酸葡聚糖。
靶DNA的变性（对mRNA的原位杂交无需此步）
样品DNA的变性在DNA-DNA杂交检测中是必须的步骤，但同时可能会造成样品形态学的部分破坏，此步是实验中需要优化的一个步骤。常用的变性方法为碱变性和热变性，实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得最佳条件。
如使用热变性方法，可在杂交时将探针的变性和样品DNA变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱80℃变性，染色体DNA样品处理2min，后冷却至37℃进行杂交。组织样品DNA的变性时间可增加至80℃10min。
杂交流程：
杂交液的成分主要影响了核酸杂交的复性动力学和热稳定性。杂交液的基础成分为：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），异源核酸（如鲱精子DNA/tRNA/竞争DNA），磷酸钠，EDTA，SDS，盐离子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及杂交探针。不同的应用中进行杂交温度、pH、盐离子、甲酰胺、探针浓度等条件的优化。常用的pH范围为6.5~7.5，较高的pH值有助于提高杂交的严谨性。
杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性，较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4M的Na离子浓度，对Tm值、双链复性速率的影响不大，但随着Na离子浓度的降低，将显著影响Tm值和双链复性速率。
有机溶剂（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等双链体的解链温度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+ 90~100℃的条件下变性，那么应用于原位杂交，样品必须在65~75℃的条件下进行长时间变性，这将导致样品形态学的破坏。50%甲酰胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。
硫酸葡聚糖具有很强的水合性，高浓度的硫酸葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境，增加了探针浓度，加快杂交反应速率。
杂交常用条件：50% 去离子甲酰胺、2x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0
1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、1x Denhardt’s、5 - 10%硫酸葡聚糖、+37 to +42°C下杂交5 min - 16 hours
对于短链的寡核苷酸探针，具有特殊的杂交动力学和杂交体稳定性，可尝试从以下杂交条件开始优化：25% 去离子甲酰胺、4x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0、1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、5x Denhardt’s、+15 to +25°C下杂交2 - 16 hours。
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胶体金标记的羊抗鸡IgGRecombinantMouseC-X-Cmotifchemokine1/CXCL1英文名称: Goat Chicken IgG/GoldKnownasGrowth-regulatedalphaprotein;C-X-Cmotifchemokine1;Platelet-derivedgrowthfactor-inducibleproteinKC;SecretoryproteinN51;Cxcl1;Gro;Gro1;Mgsa;Scyb1
PE标记的兔抗牛IgG RecombinantHumanSerpinE1英文名称: Rabbit Bov IgG/PEKnownasPlasminogenActivatorInhibitor1;PAI;PAI-1;EndothelialPlasminogenActivatorInhibitor;SerpinE1;SERPINE1;PAI1;PLANH1
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CIDEB Polyclonal AntibodyRecombinantHumanHeatShock47kDa/SERPINH1英文名称: CIDEB Polyclonal AntibodyKnownasSerpinH1;47kDaHeatShockProtein;Arsenic-TransactivatedProtein3;AsTP3;CellProliferation-InducingGene14Protein;Collagen-BindingProtein;Colligin;RheumatoidArthritis-RelatedAntigenRA-A47;SERPINH1;CBP1;CBP2;HSP47;SERPINH2
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Alexa Fluor 647标记的兔抗犬IgM抗体RecombinantHumanIL-31英文名称: Rabbit Dog IgM/Alexa Fluor 647KnownasInterleukin-31;IL-31;IL31
ACTL6A Polyclonal AntibodyRecombinantHumanCXCL1/GRO英文名称: ACTL6A Polyclonal AntibodyKnownasGrowth-RegulatedAlphaProtein;C-X-CMotifChemokine1;GRO-Alpha(1-73);MelanomaGrowthStimulatoryActivity;MGSA;Neutrophil-ActivatingProtein3;NAP-3;CXCL1;GRO;GRO1;GROA;MGSA;SCYB1
USP5 Polyclonal AntibodyRecombinantHumanEphB2/Ephrintype-Breceptor2英文名称: USP5 Polyclonal AntibodyKnownasEPHB2protein;EPHB2;Ephrintype-Breceptor2
Alexa Fluor 350标记的羊抗兔IgGRecombinantHumanCD40/TNFRSF5英文名称: Goat rabbit IgG/Alexa Fluor 350KnownasTumorNecrosisFactorReceptorSuperfamilymember5;B-CellSurfaceAntigenCD40;Bp50;CD40LReceptor;CDw40;CD40;TNFRSF5
PE-Cy5.5标记的兔抗猪IgGRecombinantHumanIL-11英文名称: Rabbit pig IgG/PE-Cy5.5KnownasInterleukin-11;IL-11;AdipogenesisInhibitoryFactor;AGIF;Oprelvekin;IL11
Alexa Fluor 555标记的兔抗人IgG细胞生物学>细胞培养耗材英文名称: Rabbit human IgG/Alexa Fluor 555
Alexa Fluor 488标记的兔抗牛IgM一次性针头过滤器0.22umMillipore.英文名称: Rabbit Bovine IgM/Alexa Fluor 488单位0.22um直径33mm独立包装250个/盒
PE标记的羊抗人IgM程序降温盒Nalgene.英文名称: Goat human IgM/PE单位个
PE-Cy7标记的羊抗人IgMT25培养瓶正方斜口不透气25cm2Corning.英文名称: Goat human IgM/PE-Cy7英文名称 Corning?25cm2RectangularCantedNeckCellCultureFlaskwithPlugSealCap
STAT3 mRNA原位杂交试剂盒英文名称:Paracoccus aestuarii，七叶副球菌
菌种又名:
中文名称:七叶副球菌
菌种代号:JCM 15119; DSM 19484; KCTC 22049; S. W. Roh, B7
分离:潮滩沉积物
来源历史:<< JCM
培养基:
66
TRYPTIC SOY BROTH OR TRYPTIC SOY AGAR (DIFCO 0369)
Tryptone 15.0 g
Soytone 5.0 g
NaCl 5.0 g
Agar 15.0 g
Distilled water 1.0 L
Adjust pH to 7.3.
培养条件:30°C 6天
菌种说明:
生物安全等级:1
规格:100T/盒
特异性: 人、大鼠、小鼠、兔
标记方式: 3’—尾段标记
保存条件: 4°C保存一年
试剂盒内容:
1.STAT3寡核苷酸探针杂交液 2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.胃蛋白酶（×10;Pepsin） 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
培养细胞和冰冻切片：
STAT3 mRNA原位杂交试剂盒准备工作：缓冲液的配备
3%柠檬酸——100ml 蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7·H2O)3g,pH2.0 左右。
2×SSC——1000ml 蒸馏水中加氯化钠 17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O，分子量 294)8.8g。
0.5×SSC——300ml 蒸馏水加 100ml 2×SSC 即可。
0.2×SSC——270ml 蒸馏水加 30ml 2×SSC 即可。
20%甘油——20ml 甘油加 80ml 蒸馏水即可。
0.5 M PBS——1000ml 蒸馏水加氯化钠 30g,Na2HPO4·12H2O 6g,NaH2PO4·2H2O 0.4g,PH7.2-7.6。
原位杂交检测步骤：
原位杂交涉及的步骤：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶DNA变性（DNA原位杂交），探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针（显色）检测。
1. 玻片的准备和样品固定
对于染色体涂片，1：1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。
样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中必不可少的步骤，从化学反应角度来看，固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大，因为核酸杂交的功能分子基团被安全地包裹在DNA双螺旋结构中，而交联剂的使用对RNA基本没有影响。对于染色体涂片，常使用甲醇/固定；石蜡包埋的组织切片用福尔马林固定。冷冻切片可通过在4%的中固定30min，或使用Bouin固定剂。
2. 样品预处理
在待测样品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹缠绕，根据不同的细胞和组织样品的应用，可选择合适的预处理方法将靶核酸暴露：
内源性酶灭活：如果探针的检测是通过酶促法进行的，则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的POD可通过含1% H2O2的处理30min。如果检测酶为AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP检测的内源性背景一般来说比POD检测的低得多，因为在杂交过程中，样品中内源性AP酶的活性基本都丧失了。
RNase处理：在DNA-DNA杂交实验中，RNase的处理可去除内源性RNA，增加实验的信噪比。在进行mRNA为靶标的检测时，RNase处理的样品也可作为质控对照。通常的处理方式是将DNase-free的RNase溶解于2×SSC (100μg/ml)，样品在溶液中37℃处理60min。
SSC=150mM NaCl, 15mM 柠檬酸钠溶液(pH7.4)
HCl处理：对样本进行20-30min的200mM HCl处理，可将蛋白抽提，并将核酸序列进行一定程度的水解，增加杂交检测的信噪比。
去垢剂处理：如果对样品的固定、脱水、包埋等预处理过程不足以将脂膜成分破坏暴露核酸，可对样品进行额外的蛋白去垢剂处理(如Triton X-100和SDS)。
蛋白酶处理：样品中待杂交的核酸序列常与蛋白缠绕交联在一起，样品的固定步骤更是加剧了蛋白的交联程度，因此预渗透是核酸杂交前的常规步骤，通常通过蛋白酶K的消化作用来完成。根据不同的文献来源，蛋白酶K的工作浓度通常设为10-500μg/ml(溶解于20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4, 酶浓度可根据具体样品进一步优化)，对样品进行37°C 7.5 –30 min的处理。染色体涂片或核片的蛋白酶K处理浓度可降至1μg/ml消化7.5 min。也有文献指出，福尔马林固定石蜡包埋的组织切片样品，使用胃蛋白酶（500μg/ml，溶于200mM HCl）将得到较好的蛋白消化结果。
对于结缔组织，肝组织等样品，还可进行Collagenase和Dispase的组织消化处理，以降低背景。
3. 探针制备
在进行研究前，确定应用的探针类型。不同探针类型的优劣势请见上文描述。DNA探针的制备包括了前期的DNA片段分离纯化（或cDNA的克隆）和酶促探针标记，可选随机引物标记法和缺口平移法等。RNA探针的制备包括了转录载体克隆和转录法探针标记。寡核苷酸探针的制备要求先获得合成的寡核苷酸片段，再进行末端标记或加尾法探针标记。但无论采用何种标记探针及标记方法，对探针标记效果需进行最终的评估，并准确计算探针浓度。
4. 原位杂交过程
杂交前可进行预杂交，以防止较高的背景染色。预杂交条件与杂交条件相同，只是预杂交液中不含探针和硫酸葡聚糖。
靶DNA的变性（对mRNA的原位杂交无需此步）
样品DNA的变性在DNA-DNA杂交检测中是必须的步骤，但同时可能会造成样品形态学的部分破坏，此步是实验中需要优化的一个步骤。常用的变性方法为碱变性和热变性，实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得最佳条件。
如使用热变性方法，可在杂交时将探针的变性和样品DNA变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱80℃变性，染色体DNA样品处理2min，后冷却至37℃进行杂交。组织样品DNA的变性时间可增加至80℃10min。
杂交流程：
杂交液的成分主要影响了核酸杂交的复性动力学和热稳定性。杂交液的基础成分为：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），异源核酸（如鲱精子DNA/tRNA/竞争DNA），磷酸钠，EDTA，SDS，盐离子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及杂交探针。不同的应用中进行杂交温度、pH、盐离子、甲酰胺、探针浓度等条件的优化。常用的pH范围为6.5~7.5，较高的pH值有助于提高杂交的严谨性。
杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性，较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4M的Na离子浓度，对Tm值、双链复性速率的影响不大，但随着Na离子浓度的降低，将显著影响Tm值和双链复性速率。
有机溶剂（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等双链体的解链温度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+ 90~100℃的条件下变性，那么应用于原位杂交，样品必须在65~75℃的条件下进行长时间变性，这将导致样品形态学的破坏。50%甲酰胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。
硫酸葡聚糖具有很强的水合性，高浓度的硫酸葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境，增加了探针浓度，加快杂交反应速率。
杂交常用条件：50% 去离子甲酰胺、2x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0
1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、1x Denhardt’s、5 - 10%硫酸葡聚糖、+37 to +42°C下杂交5 min - 16 hours
对于短链的寡核苷酸探针，具有特殊的杂交动力学和杂交体稳定性，可尝试从以下杂交条件开始优化：25% 去离子甲酰胺、4x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0、1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、5x Denhardt’s、+15 to +25°C下杂交2 - 16 hours。
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PE-CY5标记的兔抗猴IgGRecombinantHumanIL-18/IL-1F4英文名称: Rabbit Monkey IgG/PE-CY5KnownasInterleukin-18;Iboctadekin;Interferongamma-inducingfactor;IFN-gamma-inducingfactor;Interleukin-1gamma;IL-1gamma;GIF;IL-18;IL-1g;IL1F4;MGC12320
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菌种又名:
中文名称:七叶副球菌
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分离:潮滩沉积物
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培养基:
66
TRYPTIC SOY BROTH OR TRYPTIC SOY AGAR (DIFCO 0369)
Tryptone 15.0 g
Soytone 5.0 g
NaCl 5.0 g
Agar 15.0 g
Distilled water 1.0 L
Adjust pH to 7.3.
培养条件:30°C 6天
菌种说明:
生物安全等级:1
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semiboat 请问用显性负性STAT3质粒转染阻断IL-6/gp130/STAT3通道和STAT3 mRNA干扰阻断此信号通道有什么差异，在阻断此通道时是否都可以使用，园内各位XDJM有谁知道，非常感谢！！ bacchante miRNA干扰比较现代化一些。 显性负作用似乎还要考虑内源蛋白的影响，如果你的启动元件活力不够高，那么你就抑制作用可能就不明显。 另外，似乎不能rescue，也就是说，似乎显性
haohuaiyong 各位战友，最近我在做磷酸化STAT3的检测，用cell signaling公司的磷酸化检测抗体与总STAT3抗体做WB，实验组（bFGF+EGF）与阳性对照的磷酸化水平是有增加的，但总STAT3在实验组是减少的而在对照组是强表达的，我看别人的文献都是将总STAT3作为阳性内参一样，应该是不变化的啊，为什么我做了好多次都是不均一的啊？实在是搞不明白，请做过这方面的战友帮忙!谢谢！ dzhzh 你的灌注
maggertu 想请教个问题，做stat3的免疫组化，是选用stat3抗体，还是p-stat3抗体？看到国外大部分文章都做p-stat3，而国内有些文章用stat3抗体，搞不明白 zfyyzz00 stat3抗体只是检测总蛋白，看活性必须要做P-stat3。 在转录水平就应该做EMSA maggertu 谢谢，再请教一下，应该只有磷酸化的stat3才能进行核内转移，那么做stat3抗体
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