组织细胞丙二醛（MDA）检测试剂盒（TBA法）E2019

组织细胞丙二醛（MDA）检测试剂盒      E2019
描述：组织细胞丙二醛（MDA）检测试剂盒是一种灵敏简单的检测脂质过氧化产物丙二醛的试剂盒。丙二醛（Malondialdehyde, MDA）是一种生物体脂质氧化的天然产物，一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列包括MDA在内的复杂化合物，通过检测MDA的水平可评价脂质氧化的水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。
本试剂盒是一种基于MDA（thiobarbituric acid, TBA）在较高温度和酸性环境中反应生成红色MDA-TBA加和物，MDA-TBA加和物在535nm波长具有最大吸收，据此可以通过比色法进行检测。另外MDA-TBA受535nm波长激发光激发，在553nm波长发出荧光，因此，可以通过荧光法检测MDA浓度。荧光法相对比色法灵敏度提高一个数量级。
反应示意图如下：
试剂盒以比色法检测线性范围为1.56-50 μM，灵敏度≤1.56 μM；荧光法检测线性范围为0.156-5 μM，灵敏度≤0.156 μM

适用：本试剂盒能够检测动物组织、培养细胞等样本中MDA含量。
组成：

组份名称	规格	数量
组织细胞裂解液	50ml	1
MDA标准品(1mM)	200 μl/管	1
TBA	50 mg/管	1
TBA配制液	7.5 ml/瓶	1
SDS溶液	12 ml/瓶	1
BHT溶液（100×）	1 ml/管	1

储存条件：-20℃储存，一年有效。TBA配制成溶液后，可4℃避光储存一周。SDS溶液使用前，请恢复至室温并彻底溶解后使用，首次使用后4℃储存即可。
需要而未提供的试剂及器材
1. 超纯水
2. 0.1M PBS(PH7.0-7.4)和EDTA
3. 系列可调节量程移液器及吸头
4. 干净的试管、离心管及96孔板
5. 酶标仪
操作步骤：
1. 样品的准备
1.1 细胞样品的准备：收集约2×10^6～2×10⁷个新鲜细胞，PBS洗涤细胞一次，离心收集细胞，吸尽上清
加入300 μl的中等强度RIPA裂解液（提前加入100×的抗氧化剂BHT）冰浴裂解30分钟。4℃，10000g
离心10分钟。取上清用于MDA定量测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。对于细胞量差别大的样本
请利用BCA蛋白定量法测定细胞裂解液上清中总蛋白浓度，以校正MDA测定结果。
1.2 组织样品的准备：利用含1mM EDTA的PBS灌流或漂洗组织，去除组织中的血液，然后取约10 mg
组织，加入500 μl的中等强度RIPA裂解液（提前加入100×的抗氧化剂BHT），冰浴匀浆。4℃，10000g
离心10分钟。取上清用于MDA定量测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。另外请利用BCA蛋白定量
法测定组织裂解液上清中总蛋白浓度，以校正MDA测定结果。
2. 试剂盒的准备
2.1 TBA溶液的配制：将本试剂盒提供的1管50 mg TBA倒入50 ml离心管中，再加入7.5 ml TBA配置
震荡2分钟溶解TBA，然后加入17.5 ml的纯水，彻底溶解TBA，可以超声助溶，即为TBA溶液，浓度
为2 mg/ml。
3. 标准品的准备
比色法标准品的配制：在1.5 ml离心管中，加入950 μl纯水，再取50 μl的1 mM浓度MDA标准品加入离心管中配制50 μM浓度MDA标准品；然后取另外5根1.5 ml离心管，分别加入500 μl纯水，再吸取500 μl的 50 μM浓度MDA标准品依次倍倍稀释为25、12.5、6.25、3.12、1.56 μM浓度。
荧光法标准品的配制：在1.5 ml离心管中，加入1 ml纯水，再取5 μl的1 mM浓度MDA标准品加入离心管中配制5 μM浓度MDA标准品；然后取另外5根1.5 ml离心管，分别加入500 μl纯水，再将500 μl的5 μM浓度MDA标准品依次倍倍稀释为2.5、1.25、0.625、0.312、0.156 μM浓度。 
测定方法

1. 在1.5 ml离心管中，按下表进行配制：

	空白管	标准品管	样品管	对照管
纯水	100 μl			200 μl
标准品		100 μl
待测样品			100 μl	100 μl
SDS溶液	100 μl	100 μl	100 μl	100 μl
TBA溶液	200 μl	200 μl	200 μl

一般情况下,对照管每批只需做1-2支，若样本不存在溶血、脂血现象，对照管可以不做。

2. 将离心管置于95℃水浴或金属浴反应30分钟，然后冰浴冷却至室温。
3. 10000g离心10min，取200 μl上清溶液，测定吸光度（535nm）或发射的荧光强度（ex535nm-em553nm）。

数据处理
利用MDA标准品浓度为横坐标，吸光度值或发射荧光值为纵坐标制作标准曲线，并获得横纵坐标之间的函数关系式，然后利用标准曲线和各样品的吸光度值或发射荧光值计算样品的MDA浓度。细胞裂解上清和组织匀浆上清，可以计算每毫克蛋白中的MDA量MDA标曲测定结果如下图所示：
参考文献
1. Armstrong, D., and Browne, R. (1994). Free Radicals in Diagnostic Medicine. 366: 43-58. 
2. Armstrong, D., et al. (1998). Free Radicals and Antioxidant Protocols. 108:315-324.
3. Yagi, K. (1998). Free Radicals and Antioxidant Protocols. 108: 101-106.
注意事项
1. 血红蛋白对测定有一定干扰，请尽量避免血浆和血清制备过程中的溶血。
2. TBA配制成溶液后不够稳定，要在4℃避光储存，一周内用完。
3. 初次使用试剂盒时，粉末试剂和小体积液体试剂请适当离心后使用。
4. 本产品仅限专业人员用于科学研究，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。