ECMKit(大鼠IgG)哪家好

实验报告：
一、ECMKit(大鼠IgG)哪家好分离与培养：
    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；
    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；
    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；
    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；
    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；
二、免疫荧光鉴定：
    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%在室温条件下固定细胞15min；
    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；
    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；
    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；
    6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。
中文名称：ECMKit(大鼠IgG)哪家好
英文名称：
产品规格：1盒
发货周期：1～3天
用途适于一抗为大鼠IgG的WesternBlotting检测。
保存条件4℃可保存一年。
WesternBlotting检测试剂盒内容
1.封闭试剂10g蛋白质干粉(脱脂奶粉)。
2.HRP标记兔抗大鼠IgG0.1ml亲和纯化抗体，经过人血清吸附以去除交叉抗体。效价12000-10000。
3.ECM显色剂总量100ml。含A液5ml(×20倍)；B液5ml(×20倍)。每个试剂盒足够10张小膜或800c㎡面积的膜显色
工作原理
蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。根据所采用的支持物不同,可分为琼脂糖凝胶电泳、淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰凝胶电泳等。其中以聚丙烯酰凝胶电泳(PAGE)最广泛。它的优点为无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶。SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,它根据蛋白分子大小不同，迁移速率的不同而达到分离目的，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
免疫印迹是将凝胶电泳的高分辨力和免疫化学检测的特异性融为一体。免疫印迹技术首先借助凝胶电泳将蛋白质抗原分离，然后将凝胶中的蛋白质转印到膜上使之成为被分离的一个拷贝。免疫印迹为检测样品中是否存在目的蛋白提供一种可靠的方法，该法鉴定蛋白质的原理是根据被测蛋白能与特异性抗体结合的特性并通过相对迁移率来体现该蛋白的分子量。如果想要了解样品中是否存在某一抗原，以及该抗原的含量或该抗原多肽链的相对分子质量以及亚型，是否与其他蛋白结合，蛋白质的酪氨酸残基是否发生磷酸化等有关问题均可采用免疫印迹。
免疫印迹包括多个简单步骤，可在一到两天完成，该方法具有高效，简便，灵敏等特点。
实验操作步骤
1．蛋白质的样品制备
1)细胞培养蛋白质样品的制备
1胰酶消化后裂解细胞培养至80%左右密度时，以含0.25%胰蛋白酶消化,室温，低速离心，弃上清。细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入0.1-1ml裂解液(根据细胞数量定)反复吹打。
2皿上直接裂解细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入0.1-1ml裂解液(根据细胞数量定)，用细胞刮刀收集，转移至离心管中，反复吹打。
2)组织样品的制备新鲜组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，按组织净重裂解液=110的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清(如有粘稠物可超声处理)
3)蛋白变性处理后的样品加入样品缓冲液(按样品浓度11或12的比例)混匀，样品置1000C的水浴箱加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液。(样品可立即使用也可以分装冻存，-20℃可稳定保持数月。)
2．SDS-PAGE电泳
1)．制胶①按比例配制分离胶(丙烯酰母液单体双体=291)，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水或正丁醇，以阻止氧气进入凝胶溶液中，37℃恒温箱中静置60min。
②同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多的氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，37℃恒温箱中静置60min以上以保证完全聚合。
注意事项：
      尽管经测试Annexin V-FITC反复冻融5次对于其检测效果无显著影响，但为取得良好的使用效果，3-6个月内推荐4℃保存，并适当注意避免反复冻融。
      如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。
      染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
      如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，导致染色失败。
      荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。
      用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测，这样通常可以有效减少假阳性的坏死细胞。
      需自备PBS。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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培养操作步骤：
1．用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布； 
2．将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）； 
3．在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时； 
4．将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片完全浸在培养液中； 
5．将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。