操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:
第一次使用前请先在漂洗液RW 瓶、漂洗液WB 和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!
1. 组织培养细胞
a. 收集<107 悬浮细胞到一个1.5ml 离心管,对于贴壁细胞,孔板培养可以直接裂解,细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
b. 13000rpm 离心10 秒(或者300xg 离心5 分钟),使细胞沉淀下来。完全吸弃上清,留下细胞团,注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
c. 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬, 加350μl( <5×10^6细胞) 或600μl(5x106-1×10^7细胞)裂解液RLT Plus,吹打混匀后用手剧烈振荡20 秒充分裂解。
d. 匀浆:(处理细胞量极少时<1×10^5一般不需要,涡旋振荡一分钟匀浆)。用带钝针头的一次性1 ml(配0.9mm 针头) 注射器抽打裂解物5-10 次或直到得到满
意匀浆结果(或者电动匀浆30 秒) ,可以剪切DNA,降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。
e. 将裂解混合物或匀浆混合物全部加到DNA 吸附柱上(吸附柱放在收集管内)。
f. 接操作步骤项下3。
2. 动物组织(例如鼠肝脑)
a. 电动匀浆:新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,加入350μl(<20mg 组织)或者600μl(20-30mg 组织)的裂解液RLT Plus 后电动彻底匀浆20-40 秒。
b. 液氮研磨+匀浆:在液氮中研磨组织成细粉后,取适量组织细粉(20mg/30mg)转入装有350μl/600μl 组织裂解液RLT Plus 的1.5ml 离心管中, 用手剧烈振荡20秒,充分裂解。用带钝针头的一次性1 ml(配0.9mm 针头) 注射器抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30 秒) ,可以剪切DNA,降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。
c. 将匀浆后裂解物13,000rpm 离心3 分钟,沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物,将裂解物上清全部加到DNA 吸附柱上(吸附柱放在收集管内)。
d. 接操作步骤项下3。