2. 悬浮细胞产生超氧化物的检测: a. 细胞用PBS、Hanks液或生理盐水洗涤一次。 b. 约按5-10万个细胞/毫升的比例,用超氧化物检测工作液悬浮细胞。 c. 在96孔板中,每孔加入200微升用超氧化物检测工作液悬浮的细胞,每孔约1-2万个细胞。 d. 37℃孵育3分钟。 e. 在预定的检测孔中加入预计可以诱导产生超氧化物的刺激物,如PMA等,刺激10-60分钟或其它预定的时间。须至少留一个不加刺激物的孔作为空白对照。选择1-2个加刺激物的孔中加入2微升SOD以验证整个检测体系,加SOD溶液的检测可以不做。试剂盒提供的SOD溶液足够做10个检测。具体检测时的安排参考下表:
细胞
超氧化物检测工作液
刺激物
SOD溶液
空白对照
+
+
-
-
待测样品
+
+
+
-
阴性对照
+
+
+
+
f. 在450nm测定吸光度。如无450nm滤光片,可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长作为参考波长进行双波长测定。 3. 贴壁细胞产生超氧化物的检测: a. 约按每孔5000-10000个细胞(具体的细胞接种数量须根据细胞的大小和生长速度自行确定)把细胞培养到96孔板中,使第二天或待检测时细胞为80-90%满。 b. 吸去培养液,用PBS、Hanks液或生理盐水洗涤一次。 c. 每孔加入200微升超氧化物检测工作液,37℃孵育3分钟。 d. 在预定的检测孔中加入预计可以诱导产生超氧化物的刺激物,如PMA等,刺激10-60分钟或其它预定的时间。须至少留一个不加刺激物的孔作为空白对照。选择1-2个加刺激物的孔中加入2微升SOD以验证整个检测体系,加SOD溶液的检测可以不做。试剂盒提供的SOD溶液足够做10个检测。具体检测时的安排参考下表:
细胞
超氧化物检测工作液
刺激物
SOD溶液
空白对照
+
+
-
-
待测样品
+
+
+
-
阴性对照
+
+
+
+
e. 在450nm测定吸光度。如无450nm滤光片,可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长作为参考波长进行双波长测定。