使用说明: 1. 初始反应条件(适用于绝大多数GST标签蛋白的酶切) a. 反应温度:4°C。 b. 反应时间:16 h或过夜。 c. 酶量:1:25~1:100(U/μg)。 2. 反应条件的优化 由于不同标签蛋白具有不同的特性,所以在实际使用时,建议对酶和标签蛋白的比例进行适当优化,以下是一个简单的估计酶用量的实验方案。 a. 按照下表设置酶切反应体系:
组分
体积(μl)
H2O
X
10X PreScission Buffer
10
标签蛋白(100μg)
Y
PreScission Protease (2U/μl)
0、0.5、1或2
总体积
100
注:如果标签蛋白浓度为5μg/μl,那么Y=100/5=20,即须使用20μl 5μg/μl的标签蛋白。 b. 将反应混合物放置于4°C反应16小时或者过夜。 c. 取20μl样品进行SDS-PAGE电泳分析,确定反应所需的合适酶量。在实际操作过程中,如果有必要,还可以在反应的不同时间点取少量样品,后续通过电泳分析来确定优化的反应时间。 3. 柱上酶切含GST标签的融合蛋白(以8mg GST标签蛋白/ml凝胶为例,不同量的GST标签蛋白可以按此比例换算) a. 在GST标签蛋白结合于纯化柱(1ml)并用洗涤液充分洗涤后,再用10倍柱床体积PreScission Protease的酶切缓冲液平衡柱子。PreScission Protease的酶切缓冲液的组分为50mM Tris-HCl,150mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,pH7.5。 b. 准备PreScission Protease:约每100μgGST标签蛋白使用2U PreScission Protease (或按照经步骤2优化后的条件)。对于8mg GST标签蛋白需使用160U PreScission Protease,用PreScission酶切缓冲液稀释至与凝胶柱相同的体积,即1ml。 c. 将稀释好的1ml PreScission Protease泵入纯化柱中,4°C保持4-8h(为确保酶切完全,可以4°C酶切过夜)。如果蛋白结合是在离心管中进行的,可将准备好的PreScission Protease直接加入离心管中,4°C在摇床上缓慢摇动4-8小时(为确保酶切完全,可以4°C酶切过夜)。 d. 用1倍柱床体积的PreScission Protease酶切缓冲液洗涤,重复三次,分别收集每次的洗涤液。如果酶切反应是在离心管中进行的,1000g离心2分钟,收集上清,然后加入1ml酶切缓冲液重悬沉淀,离心(1000g×2min)收集上清,接着再加入1ml酶切缓冲液重悬沉淀,离心(1000g×2min)收集上清。洗脱组分中含有切除了GST标签的目的蛋白,而GST标签和带有GST标签的PreScission Protease则仍然结合在凝胶柱上。 4. 洗脱后酶切含GST、His等标签的融合蛋白(以8mg标签蛋白/ml凝胶为例,不同量的GST标签蛋白可以按此比例换算) a. 使用脱盐柱快速除去洗脱组分中的GSH、咪唑等特殊组分,或用PreScission Protease酶切缓冲液进行透析。 b. 按每100μg标签蛋白加入2U PreScission Protease的比例加入蛋白酶,如果蛋白未定量,可以按照每1ml凝胶加入160U PreScission Protease (按照每毫升凝胶结合8mg标签蛋白进行预估)的比例进行。4°C孵育4-8h或者过夜。 c. 将酶切后的蛋白样品加入预先用PreScission Protease酶切缓冲液平衡好的BeyoGold™ GST-tag Purification Resin,室温结合20-30分钟。 d. 500g离心5分钟,收集上清,其中含有切除了标签的目的蛋白,PreScission Protease则结合在凝胶沉淀中。如果目的蛋白是GST标签蛋白,那么残留的没有被酶切的GST标签蛋白、PreScission Protease和酶切下来的GST标签则结合在凝胶沉淀中,切除了标签的目的蛋白在溶液中。