Klenow Fragment, Exo-

Klenow Fragment, Exo-

Klenow Fragment，Exo-，即没有外切酶活性的Klenow片段，是大肠杆菌聚合酶I(E.coli.DNA polymerase I)的大片段
(Large Fragment)缺失了外切酶活性的突变体。Klenow Fragment，Exo-保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性，但缺少完整
的Klenow酶的5'→3'和3'→5'外切酶活性。
特点：由于Klenow Fragment，Exo-没有外切酶活性，其在末端补平时经常会在3'末端额外加上1个或多个核苷酸，因此不能用于产生平末端而用于后续的连接。
用途：5'突出末端的标记；随机引物法进行DNA标记；Sanger双脱氧法进行DNA测序等。 
来源：由大肠杆菌表达，表达基因的来源为突变的 polA 基因片段。
分子量：约68kDa(单体)。
活性定义：37℃30分钟内，催化10nmol脱氧核糖核苷酸(dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。
酶活性检测条件：67mM potassium phosphate(pH7.4)，6.7mM MgCl₂，1mM 2-mercaptoethanol，0.033mM 
dATP，0.033mM dTTP，0.4MBq/ml[³H]-dTTP，62.5μg/ml poly(dA-dT)·poly(dA-dT)。
纯度：不含DNA内切酶，不含RNase。
酶储存溶液：25mM Tris-HCl(pH7.5)，0.1mM EDTA，1mM DTT，50%(v/v)glycerol。
Reaction Buffer(10X)：500mM Tris-HCl(pH8.0 at 25℃)，50mM MgCl₂， 10mM DTT。
缓冲液兼容性：在信裕生物的内切酶反应缓冲液1X O、1X R、1X Y、2X Y中的活性为100%，在1X B、1X G中的活性为100%；在信裕生物的Taq、Pfu DNA polymerase和M-MuLV反应缓冲液中的活性为100%。
失活或抑制：75℃加热10分钟或加入适量EDTA均可导致Klenow Fragment，Exo-失活。金属离子螯合剂，无机焦磷酸盐(PPi)，大剂量的无机磷酸盐(Pi)均对Klenow Fragment，Exo-有抑制作用。
包装清单：

产品编号	产品名称	包装
XY-7039-1	Klenow Fragment, Exo-(5U/μl)	100U
XY-7039-2	Reaction Buffer(10X)	0.3ml
－	说明书	1份

保存条件：
-20℃保存。
注意事项： 
酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 

使用说明：
1. 随机引物法进行DNA标记：
a. 参考如下表格设置反应体系：

DNA	10μl(100ng)
Reaction Buffer(10X)	5μl
125μM random decamer or hexamer primer	10μl
补充无核酸酶的去离子水	至40μl
混匀后沸水浴孵育5-10分钟，立即置于冰浴冷却。进行后续步骤前离心沉淀液体。
3 dNTP Mixture(0.25mM each , without the labeled dNTP)	4μl
[α-32P]-dNTP, ～110 TBq/mmol(3000Ci/mmol)	1.85MBq(50μCi)
Klenow Fragment，Exo-	1μl(5U)
补充无核酸酶的去离子水	至50μl

b. 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 对于random decamer primer，37℃孵育5分钟；对于random hexamer primer，37℃孵育10分钟。
d. 加入4μl 0.25mM dNTP，混匀后37℃孵育5分钟。
e. 加入1μl 0.5M EDTA，pH8.0终止反应。
f. 取1μl上述液体用于检测标记的效率。
g. 用Sephadex G-50或Bio-Gel P-60或其它适当试剂盒纯化标记好的探针。
2. 双链DNA 5'突出(5'overhang)末端的标记：
a. 参考如下表格设置反应体系：

Digested DNA	10～15μl(0.1～4μg)
Reaction Buffer(10X)	2μl
[α-32P]-dNTP, ～15-30 TBq/mmol(400-800Ci/mmol)	0.74 MBq(20μCi)
或[α-32P]-dNTP, ～110 TBq/mmol(3000Ci/mmol)	2.96 MBq(80μCi)
3 dNTP Mixture(2.5mM each, without the labeled dNTP)	2μl
Klenow Fragment, Exo-	0.2μl(1U)
补充无核酸酶的去离子水	至20μl

b. 按上述体系配好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 30℃孵育15分钟。
d. 75℃孵育10分钟终止反应。
3. 其他用途可以参考上述用途或适当的文献资料进行。