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- 2025年07月13日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
30
- 英文名：
Hydroxyproline assay kit
- 保质期：
详见说明书
- 供应商：
上海研生
- 保存条件：
低温冷藏
- 规格：
50管/48样
1．羟脯氨酸测定试剂盒(消化法)(测培养细胞、培养液)价格用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布；
2．将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）；
3．在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时；
4．将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片完全浸在培养液中；
5．将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。
中文名称：羟脯氨酸测定试剂盒(消化法)(测培养细胞、培养液)价格英文名称：Hydroxyproline assay kit
产品规格：50管/48样
发货周期：1～3天
发货周期：1～3天
检测指标：羟脯氨酸;Hyp
本试剂盒可测动物血清（浆）、组织及培养细胞、培养液、体液等样本中羟脯氨酸含量。羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4%，在弹性蛋白中占极少量，其它蛋白中均不存在。而胶原蛋白大多分布在皮肤、腱、软骨、血管等处，因此羟脯氨酸的量能反映结缔组织疾病的胶原代谢情况。有人把皮肤中羟脯氨酸的测定作为筛选抗衰老药物的一个指标。在发育阶段随年龄的增长，其羟脯氨酸在尿中排泄增加，而发育停止后稳定。老年人的羟脯氨酸比年轻人要少。鼠患有自发性高血压及继发性高血压时，尿中羟脯氨酸含量增加。手术创伤会导致尿羟脯氨酸排泄量的增加，因高脂、低蛋白、酒精中毒及毒物、营养不良，或肝细胞变性坏死，通过炎症使纤维增加，分割肝小叶，导致肝硬化。肝纤维化时，肝内主要增加的成分为胶原纤维，羟脯氨酸为胶原纤维所特有，测定肝羟脯氨酸的含量，可换算成肝胶原蛋白的含量，以反映肝纤维化程度。胶原纤维分解主要依赖胶原酶和其它蛋白酶的作用，其分解产物羟脯氨酸从尿中排出，测定尿羟脯氨酸的含量，可反应胶原降解的情况。通过测定组织及尿中羟脯氨酸的含量，一方面可以判断纤维化程度，同时可以筛选预防与治疗的药物。
产品优点如下：
1、稳定性好：试剂盒2～8℃存放6个月有效。
2、再现性好：变异系数CV=2.1%。
3、回收试验： X =102%。
4、受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强。
5、测试面广：可测动物血清(浆)、组织 、尿液以及各种水产等，效果均佳。
实验报告：
一、分离与培养：
1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；
2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；
3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；
4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；
5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；
二、免疫荧光鉴定：
1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%在室温条件下固定细胞15min；
2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；
4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；
5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；
6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。
注意事项：
尽管经测试Annexin V-FITC反复冻融5次对于其检测效果无显著影响，但为取得良好的使用效果，3-6个月内推荐4℃保存，并适当注意避免反复冻融。
如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。
染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，导致染色失败。
荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。
用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测，这样通常可以有效减少假阳性的坏死细胞。
需自备PBS。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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文献和实验反应速率 ④.底物浓度：酶被饱和 ⑤. 酶浓度 ⑥. 温度 ⑦. pH值 3. 酶的提取 ①. 破碎方法 机械匀浆法、超声波法、冻融法、渗透压法、酶消化法。 ②. 冻融液 需加入蛋白酶抑制剂PMSF、配合剂EDTA、还原剂DTT等防止破坏目的酶。 ③. 酶消化法 利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶对细胞膜或细胞壁的酶解作用，使细胞崩解破裂。 4. 酶失活原因 1. 蛋白酶水解和自溶作用 酶在使用和储藏过程中的失活常是由于微生物和外源蛋白水解酶作用的结果。 2. 聚合作用 3. 极端pH值 4. 氧
溶解RNA样品，55-60℃5-10min。注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。12、测O.D值定量DNA浓度。注：1）此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间。2) 产率估计：组织标本：（ug RNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ug RNA/106 Cell）：5-15ug。注：1、组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量。2、组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染。3、高蛋白，脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮
[试剂与仪器](1)RNA提取试剂：TRIZOL试剂(GibcolNo15596-026)(2)DEPC处理的双蒸水，乙醇(3)RPMI-1640，胎牛血清(FCS)，ConA(刀豆蛋白A)(4)CO2培养箱(5)无菌操作台和离心机等 [操作步骤](1)收集培养细胞，用RPMI-1600培养液离心洗涤3次，第二次离心洗涤时用RPMI-1640培养液调整细胞数至5×106~1×107细胞(2)最后一次洗涤时吸1ml细胞悬液至1.5mlEP管中，在台式离心机离心，弃上清加入
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