pCMV-GFP-p62

pCMV-GFP-p62是碧云天自行研发的在哺乳动物细胞中表达GFP标签的人源p62融合蛋白的质粒，该质粒含有CMV启动子，为卡那霉素抗性，转染细胞后能够在靶细胞中高效表达绿色荧光蛋白GFP标签的p62融合蛋白，呈现明亮的绿色荧光，可以用于细胞自噬(autophagy)的研究。本质粒转染细胞后，可以使用G418筛选稳定表达融合蛋白的细胞株。
p62也称sequestosome I (SQSTM1)，在多细胞生物(不包括植物和真菌)中高度保守，主要分布于细胞质，也可以定位于细胞核、自噬体(autophagosome)和溶酶体(lysosome)中。p62是一种应激诱导的蛋白，可以作为信号枢纽(signaling hub)在氨基酸感应(amino acid sensing)和氧化应激等许多细胞事件中发挥重要作用，并且还可以作为PKC、ERK1、mTORC1、NF-кB和caspase-8等的支架蛋白(scaffold protein)而参与相应的信号转导。p62全长440个氨基酸，包含一个PB1(Phox1/Bem1p)结构域，一个锌指结构域(ZZ)，两个核定位信号(NLS1和NLS2)，一个TB (TRAF6 binding)结构域，一个LIR结构域(LC3-interacting region)，一个KIR结构域(Keap1-interacting region)，和一个C端的UBA(Ubiquitin-associated)结构域。N端的PB1结构域负责p62寡聚化以及与其它含PB1结构域的蛋白相互作用。UBA结构域对于寡聚化的p62形成蛋白聚集体是必须的，特别是当细胞暴露于氧化环境中，其作为信号组织中心负责招募泛素化修饰的蛋白底物。作为支架蛋白，p62通过其UBA结构域与蛋白聚集体(protein aggregate)相结合并将其导向自噬体从而将其降解。LIR结构域含有一个富含酸性氨基酸和疏水氨基酸的簇(DDD和WxxL)，该酸性簇和LIR结构域的其它两个关键氨基酸Trp338/Leu341可与LC3蛋白中的多个位点 (N端的碱性氨基酸以及LC3的ubiquitin fold表面的两个疏水口袋)相互作用。LIR结构域与Atg8/LC3的相互作用负责引导泛素化的蛋白到蛋白酶体(proteasome)或自噬体中降解。p62与LC3的荧光共定位和在免疫共沉淀实验过程中被一起沉淀(pull down)，说明它们参与了自噬过程中同一蛋白复合物的形成。在自噬起始的时候，p62与蛋白聚集体的复合物与LC3在自噬体的表面相结合，进而起始了蛋白聚集体的降解过程。p62与LC3蛋白的相互作用对于p62自身的自噬降解也是必须的，抑制自噬将导致p62的大量堆积，然后形成p62和泛素染色阳性的聚集体。Caspase-8被报道与p62相互作用，从而起始非死亡受体依赖的细胞凋亡信号通路。p62的功能异常与人类的多种疾病紧密相关，在肝功能紊乱，肿瘤和多种神经退行性疾病的病人样品中发现了异常堆积的p62聚集体。p62是蛋白聚集物(protein aggregates)中的常见组分，例如帕金森氏病(Parkinson disease)中的Lewy body，艾滋海默病(Alzheimer's disease)的神经纤维缠节(neurofibrillary tangles)，Huntingtin disease病人的huntingtin aggregates中均含有p62。在佩吉特氏骨病(Paget's disease of bone)，肌萎缩性脊髓侧索硬化症 (amyotrophic lateral sclerosis)以及额颞叶变性(frontotemporal lobar degeneration)等疾病中都有p62的突变被报道。
自噬(Autophagy)是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。自噬与多种生理功能有关，在饥饿等不利的环境条件下，细胞通过自噬降解多余或异常的细胞内组分，为细胞的生存提供能量及原材料，促进生物体的生长发育、细胞分化及对环境变化产生应答。自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。由于细胞自噬在生理和病理过程中都有重要作用，自噬已经成为细胞生物学领域的一个新的研究热点。
在用pCMV-GFP-p62转染细胞后，荧光显微镜下GFP-p62通常以绿色点状 (puncta)或较为弥散的斑块状(speckles)荧光存在于细胞质和细胞核中。在自噬被抑制的情况下，这种绿色的点状或斑块状物其大小会变大而且数目会变多。p62的荧光标记对于自噬的诱导、自噬的抑制以及蛋白聚集体的清除都是一个非常好的研究工具。
pCMV-GFP-p62质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
CMV promoter	1-602
T3 promoter and T3 primer binding site	620-639
GFP	699-1412
p62	1425-2747
T7 promoter and T7 primer binding site	2851-2872
SV40 polyA signal	2884-3267
f1 origin of ss-DNA replication	3405-3709
bla promoter	3734-3858
SV40 promoter	3878-4216
Neomycin/kanamycin resistance ORF	4251-5042
HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal	5043-5501
pUC origin	5630-6297

pCMV-GFP-p62质粒(6349bp)的图谱如下：

pCMV-GFP-p62质粒的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D2817 pCMV-GFP-p62.pdf。

pCMV-GFP-p62中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pCMV-GFP-p62)包括：

AfeI	AflII	AgeI	AhdI	AscI	AsiSI	BbvCI
BcgI	BsiWI	BstZ17I	FseI	NruI	PflMI	PmeI
PmlI	PspXI	SbfI	ScaI	SgrAI	SwaI	XmnI

pCMV-GFP-p62中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pCMV-GFP-p62 once)包括：

NdeI	CA`TA,TG	240	EarI	CTCTTCN`NNN,	2259
SnaBI	TAC|GTA	346	BspQI	GCTCTTCN`NNN,	2259
NheI	G`CTAG,C	597	BbsI	GAAGACNN`NNNN,	2440
BmtI	G,CTAG`C	601	EcoRI	G`AATT,C	2760
Eco53kI	GAG|CTC	653	SalI	G`TCGA,C	2772
SacI	G,AGCT`C	655	BglII	A`GATC,T	2778
AleI	CACNN|NNGTG	661	XhoI	C`TCGA,G	2784
NotI	GC`GGCC,GC	668	PaeR7I	C`TCGA,G	2784
TspMI	C`CCGG,G	680	XbaI	T`CTAG,A	2790
XmaI	C`CCGG,G	680	SpeI	A`CTAG,T	2796
SmaI	CCC|GGG	682	PspOMI	G`GGCC,C	2802
SrfI	GCCC|GGGC	682	ApaI	G,GGCC`C	2806
BstEII	G`GTNAC,C	878	PvuI	CG,AT`CG	2884
BaeI	,(N)5`(N)10ACNNNNGTAYC(N)7,(N)5	1039+1072	BclI	T`GATC,A	3038
BssHII	G`CGCG,C	1473	MfeI	C`AATT,G	3131
BlpI	GC`TNA,GC	1566	BtsI	GCAGTG,NN`	3220
BspEI	T`CCGG,A	1978	MluI	A`CGCG,T	3267
BmgBI	CAC|GTC	2049	SfiI	GGCCN,NNN`NGGCC	4154
AclI	AA`CG,TT	2140	Tth111I	GACN`N,NGTC	4497
PshAI	GACNN|NNGTC	2232	PflFI	GACN`N,NGTC	4497
BsmBI	CGTCTCN`NNNN,	2240	RsrII	CG`GWC,CG	4895
Esp3I	CGTCTCN`NNNN,	2240	BstBI	TT`CG,AA	5061
SapI	GCTCTTCN`NNN,	2259	PciI	A`CATG,T	6297

pCMV-GFP-p62质粒中推荐使用的测序引物序列如下：
T3 primer(620-639): 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'
T7 primer (2851-2872): 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'
pCMV-GFP-p62的全序列信息请参考碧云天网站上该质粒的信息。
包装清单：

产品编号	产品名称	包装
D2817-1μg	pCMV-GFP-p62	1μg
D2817-100μg	pCMV-GFP-p62	100μg
—	说明书	1份

保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。