NHS磁珠北京品牌

特别提示：包括NHS磁珠在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：NHS磁珠
英文名称：NHS
产品货号：CZ019
产品规格：1ml/5ml/50ml

产品简介：
NHS表面为NHS基团修饰，能够与带有伯胺基团的蛋白和其他分子形成稳定的肽键，用于亲和纯化抗体、抗原和其他生物分子。与传统的羧基、氨基磁珠相比，表面含NHS基团的磁珠无需事先采用EDC/NHS或戊èr醛进行活化，只需简单地将含伯氨基的生物配体溶解在试剂盒自带的Coupling Buffer中，室温下将蛋白与NHS磁珠混合1～2 h便可将生物配体共价偶联到磁珠上，具有操作简单、偶联条件温和、生物配体偶联快速高效等优点。磁珠偶联过程必需在不含任何氨基的缓冲溶剂中进行。人工操作时，使用磁性分离架实现磁珠与溶剂分离。也可采用自动化设备操作，自动化操作适合用于多样品的筛选。
蛋白偶联操作优化点：
1. 其中磁珠洗涤要严格按照说明书采用冷却的Washing Buffer A(①)快速洗涤 ，以防磁珠在洗涤过程中NHS基团水解；
2. 蛋白偶联过程中， 首先要通过实验确定合适的 Coupling Buffer(主要包括 Coupling Buffer A(②)、 Coupling Buffer B(③)、50 mMpéng酸溶液，pH 8.5、100 mM磷酸缓冲液，100 mM NaCl，pH 7.4这四种)；
3. 确定合适的Coupling Buffer后，再以此Coupling Buffer为基础，确定合适的偶联蛋白浓度，因为蛋白浓度越高，偶联到磁珠上的蛋白的量会越大(这是由于NHS基团跟蛋白偶联和NHS基团本身水解是一对竞争反应)。当然此处要综合考虑使用性能和成本，有些客户偶联少量的蛋白便可满足使用需求，这时采用低浓度的蛋白便可，这样可以降低成本。
4. 封闭这一步可以采用试剂盒中自带的3 Myǐ醇胺，也可使用Tris缓冲液(100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0)，封闭时间不得低于2 h，如果化学封闭后背景仍然很高，还可以额外加一步BSA封闭。
蛋白偶联操作步骤
以下操作过程以取磁珠样品500 μL，采用1.5 mL EP管为例介绍。用户可根据自身需求按比例调整：
1. 蛋白溶液配制：
取适量待偶联蛋白用Coupling Buffer溶解，配成浓度为≥3.0 mg/mL的蛋白溶液。已经保存于buffer 中的蛋白，需要通过透析或者脱盐的方法彻底除去原有buffer里含伯胺基的物质，然后再用Coupling Buffer配成浓度为≥3.0 mg/mL的蛋白溶液，将配制好的蛋白溶液于4℃保存备用。
注：(1)为了达到更好的性能，蛋白浓度≥3.0 mg/mL，这样偶联效率会更高，此处需综合考虑成本和使用要求；
(2)蛋白溶液中不能含有带伯氨基的成分，比如Tris，甘氨酸，明胶，BSA等；
2. 取500 μL 20%的磁珠悬浮液于1.5 mL EP管中。
注：磁珠取样前要反复颠倒、使用涡旋振荡器使其混合均匀，以保证实验的同一性，每取一次样需要重新混匀。
3. 将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。
4. 加1 mL 2～8℃的Washing Buffer A(①)于离心管中，涡旋15 s，使磁珠混合均匀。
5. 将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。
6. 加200 μL 蛋白溶液于EP管中，涡旋30 s，使其混合均匀。
注：磁珠洗涤后要立即加入蛋白溶液。
7. 将EP管涡旋15 s，置于垂直混合仪上，室温混合2～4 h。如果垂直混合不均匀，则反应前30 min，每隔 5 min 取下EP管涡旋15 s。此后，每隔15 min，取下EP管涡旋15 s。
注：如有需要可以在4℃反应过夜。
8.采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液。
9. 加1 mL Blocking Buffer(④)于EP管中，涡旋30 s，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。
注：Blocking Buffer(④)除了试剂盒中提供的3 M yǐ醇胺外，也可以使用100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0等其它封端试剂。
10. 重复“步骤9”四次。
11. 加1 mL Blocking Buffer(④)于EP管中，涡旋30 s，将EP管置于垂直混合仪中室温反应2 h。
12. 将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。
13. 加1 mL 超纯水于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。
14. 加1 mL Storage Buffer(⑤)(比如含0.05%dié氮化钠的PBS缓冲液，或者客户根据自己实际需求选择合适的保存溶液 )于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重复该操作2次。
15. 加入1mL Storage Buffer(⑤)于EP管中，充分混合，4℃C保存备用。
注：最终偶联蛋白的磁珠浓度为10% (v/v)。
注意事项：
1. 磁珠对水分敏感。为了保证产品质量，在取样之后需立即盖上瓶盖，并用封口膜密封，于4℃保存。
2. 禁止将磁珠干燥或冷冻。干燥和冷冻操作可能导致磁珠的聚集从而丧失结合活性。
3. 可通过间接法(e.g., Thermo Scientific™ Pierce™ 660 nm Protein Assay, Product No. 22660 and 22662)测定反应前后蛋白含量，或通过直接法(e.g.,use the Thermo Scientific™ Pierce™ Micro BCA ProteinAssay ，Product No. 23235)检测偶联到磁珠表面的蛋白含量，使用280 nm附近的波长来测定蛋白含量是不可取的，因为NHS基团在280 nm波长附近有很强的吸收，会严重干扰检测结果。蛋白稳定剂(如BSA，gelatin)会抑制抗体与磁珠的结合，因此在磁珠偶联抗体过程中，需要确保抗体保存体系中不存在含伯氨基的蛋白稳定剂。
4. 缓冲液中含有带伯胺的物质会抑制蛋白质偶联到磁珠表面，去除伯胺物质可采用透析和脱盐的方法。
5. NHS基团易水解，故在用Washing Buffer A洗涤时，一定要参照说明书进行。
6. 蛋白溶液要预先配制好，Washing Buffer A洗涤完毕后，要立即加入蛋白溶液进行偶联反应。
7. 蛋白质和磁珠的偶联效率因蛋白质种类和性质差异而不同。一般而言，蛋白质浓度为≥3.0 mg/mL时利于蛋白质偶联；然而，对于不同的蛋白其浓度需要优化。

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