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文献和实验科研君们,当埋头实验几月找到了目标基因片段,电泳时条带却突然消失了;千辛万苦分离纯化的物质,色谱图中却意外出现杂质峰,苦苦查询,可能仍找不到问题原因。若问题只在小小的吸头上,科研君的心还能淡定吗? 吸头的问题在哪里,如何保证纯净无污染的吸头?需要考虑以下几方面因素: 一、 吸头材质 吸头市场上,原材料基本都是聚丙烯塑料(低吸附,化学惰性高,使用温度范围广,无色透明)。也许大家不知道的是,同样是聚丙烯,品质会有大的差别。高品质的吸头一般采用天然 100% 纯聚丙烯,而低廉的吸头则很多
药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。8.避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。实验步骤贴壁细胞:1.收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。2.5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可
(6)个,反复吹打,溶解均匀细胞(轻吸,不要倒吸倒棉花上,初次就选用大的吸管) 3. 带双层手套,混合好的样品全部移置到0.1ml的EP管中,室温15-30度静置5分钟 4. 加入0.2ml氯仿/1mlTrizol,盖好EP管,剧烈振荡(上下颠倒),15秒钟,室温静置2-3min 5. 2-8度,离心,10500rpm/min,15min,取上清,用200ul在20ul刻度使用,小心不要使界面混淆,剩余界面上不要) 6. 上清中加入等量的异丙醇(一般是0.5:1),颠倒5次(用200ul枪加
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