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- 2025年12月06日
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在1980年代，基因靶向技术的出现使得我们可以将特定的变化引入小鼠基因组。利用这些早期技术，研究人员首先要将突变引入小鼠胚胎干细胞（ESC）系，富集并选择已成功整合所需突变的细胞，然后从这些经过工程改造的ESC中衍生出小鼠。为此，需要将工程化的ESC注入发育中的小鼠胚胎中，使胚胎发育成嵌合小鼠（成年小鼠中的一部分细胞来自工程化ESC），嵌合小鼠通过交配以产生完全转基因的后代。尽管功能强大，但该技术使用起来很麻烦，效率不高，通常需要一年多的时间才能构件好模型，并且不能总是保证其成功。
而CRISPR/Cas9的出现正在彻底改变小鼠基因编辑领域，使用CRISPR/Cas9可以做到比以往更容易地操作小鼠基因组。今天小编尝试说一说使用CRISPR/Cas9技术构建Knockin小鼠用到的donor设计时需要考虑的原则。
1、knockin位点与DSB距离：使用HDR(Homology Directed Repair)模板创造特定的突变或者插入一段序列需要在插入序列两端加上一段同源序列。通常修饰的插入位点应距DSB不超过100bp，最理想的是不超过10bp。距离达到200bp可能也会有效，但效率会降低。
2、knockin片段的大小：插入片段的大小是影响使用ssODN或者dsDNA作为修改模板的重要因素。很多文献报道可以使用ssODN模板成功引入高达50bp的突变或单点突变，而使用dsDNA质粒作为修复模板则应用于较大片段的插入，例如荧光蛋白或基因表达盒。
3、同源臂的长度：对于ssODN，有文章已报到成功地完成了模板总长度约为100-200bp的插入，通常在预期突变的任一侧具有接近50-80bp的同源臂。而对于大片段的插入，通常需要质粒作为修复模板，突变片段越大，需要的左右同源臂长度越长，一般在600到2000之间。同时大片段的插入最好引入选择标记，用于确认实验是否成功。
4、防止二次切割：一旦引入并修复了DSB，CRISPR/Cas9系统就不会停止。只要gRNA目标位点/ PAM位点保持完整，Cas9核酸内切酶将继续切割，DSB将通过NHEJ或HDR继续得到修复。为了避免此种情况，可以将对应sgRNA的PAM或邻近PAM的序列进行同义突变，以防止donor质粒插入基因组前后被CAS9识别并切割。
5、左右同源臂的模板选择：左右同源臂建议以待突变的目的细胞基因组为模板扩增，避免不同细胞基因组差异导致左右同源臂不同源，降低HDR效率。
Knockin实验的成功，除了donor的选择，实验之前保证sgRNA的特异性，验证sgRNA的切割活性对于Knockin实验的成功也非常重要。
而CRISPR/Cas9的出现正在彻底改变小鼠基因编辑领域，使用CRISPR/Cas9可以做到比以往更容易地操作小鼠基因组。今天小编尝试说一说使用CRISPR/Cas9技术构建Knockin小鼠用到的donor设计时需要考虑的原则。
1、knockin位点与DSB距离：使用HDR(Homology Directed Repair)模板创造特定的突变或者插入一段序列需要在插入序列两端加上一段同源序列。通常修饰的插入位点应距DSB不超过100bp，最理想的是不超过10bp。距离达到200bp可能也会有效，但效率会降低。
2、knockin片段的大小：插入片段的大小是影响使用ssODN或者dsDNA作为修改模板的重要因素。很多文献报道可以使用ssODN模板成功引入高达50bp的突变或单点突变，而使用dsDNA质粒作为修复模板则应用于较大片段的插入，例如荧光蛋白或基因表达盒。
3、同源臂的长度：对于ssODN，有文章已报到成功地完成了模板总长度约为100-200bp的插入，通常在预期突变的任一侧具有接近50-80bp的同源臂。而对于大片段的插入，通常需要质粒作为修复模板，突变片段越大，需要的左右同源臂长度越长，一般在600到2000之间。同时大片段的插入最好引入选择标记，用于确认实验是否成功。
4、防止二次切割：一旦引入并修复了DSB，CRISPR/Cas9系统就不会停止。只要gRNA目标位点/ PAM位点保持完整，Cas9核酸内切酶将继续切割，DSB将通过NHEJ或HDR继续得到修复。为了避免此种情况，可以将对应sgRNA的PAM或邻近PAM的序列进行同义突变，以防止donor质粒插入基因组前后被CAS9识别并切割。
5、左右同源臂的模板选择：左右同源臂建议以待突变的目的细胞基因组为模板扩增，避免不同细胞基因组差异导致左右同源臂不同源，降低HDR效率。
Knockin实验的成功，除了donor的选择，实验之前保证sgRNA的特异性，验证sgRNA的切割活性对于Knockin实验的成功也非常重要。
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