使用说明:
1. DNA 5" 末端标记:
a. 参考如下表格设置反应体系:
待磷酸化DNA—————————————————1~20pmol (5" 末端)
Reaction Buffer A (10X)———————————2µl
[γ-32P or γ-33P]-ATP (3,000Ci/mmol)————20pmol
补充无核酸酶的去离子水 ———————————至19µl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl)——————1µl
b. 按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 加入1µl 0.5M EDTA (pH8.0)混匀,以终止反应。
e. 后续可以使用酚*仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向百奥莱博订购。
2. DNA 5’ 末端磷酸化:
a. 参考如下表格设置反应体系:
待磷酸化DNA————————————————1~20pmol (5" 末端)
Reaction Buffer A (10X)——————————2µl
0.1mM ATP—————————————————1µl
补充无核酸酶的去离子水 ——————————至19µl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl)—————1µl
b. 按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 加入1µl 0.5M EDTA (pH8.0)混匀,以终止反应。
e. 后续可以使用酚*仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向百奥莱博订购。
3. 通过交换反应(exchange reaction)进行DNA 5" 末端标记:
a. 参考如下表格设置反应体系:
待磷酸化DNA——————————————————1~20pmol (5" 末端)
Reaction Buffer B (10X)————————————2µl
[γ-32P or γ-33P]-ATP (3,000Ci/mmol)—————40pmol
24% PEG Solution ———————————————4µl
补充无核酸酶的去离子水 ————————————至19µl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl)———————1µl
b. 按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 加入1µl 0.5M EDTA (pH8.0)混匀,以终止反应。
e. 后续可以使用酚*仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向百奥莱博订购。