GV3101根癌农杆菌感受态细胞

中文名称:    GV3101根癌农杆菌感受态细胞

菌种名称:    GV3101、GV3101感受态细胞、GV3101根癌农杆菌

英文名称:    Agrobacterium tumefaciens

基因型:    C58 (rifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR) Nopaline

抗性:    利福平（工作浓度20ug/ml）和庆大霉素（工作浓度40ug/ml）

生长条件    28度，需氧

培养基:    LB培养基或者YEB培养基

转化方法:    化学转化，或者电转化

产品应用    拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。

生长条件:    37 ℃,  有氧

GV3101根癌农杆菌感受态细胞

菌株说明:    

GV3101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 质粒含有筛选标签：gent，赋予GV3101菌株庆大霉素抗性，适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作，本公司生产的GV3101化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，pCAMBIA2301质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取-80℃保存的农杆菌GV3101感受态细胞于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
 
2.每100 μl感受态加入0.01-1 μg质粒DNA（转化效率较高，次使用前做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
 
3. 加入700 μl无抗生素的LB培养基或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2~3小时。
 
4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天
 
（当平板只含有50 μg/ml kan 时，28℃培养48 h即可；平板中同时加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 时，需28℃培养60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 则需要28℃培养72-90 h）。

GV3101根癌农杆菌感受态细胞

注意事项
 
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
 
2. 混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。
 
3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。
 
4. 利福平浓度不应高于25 μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。
 
5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入Ti质粒筛选抗生素可防止Ti质粒丢失，但Ti质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素，Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。