pCDNA3.1-6×His-Ubiquitin-K48R人

核基质结合区修饰的附着体载体介导的EGFP基因体外表达

非病毒载体介导的基因治疗有许多优点，但就目前大多数表达体系而言普遍存在外源基因表达水平低而短暂等问题为了使外源基因稳定持续表达，必须对质粒DNA 进行改造。附着体质粒载体(episomal vector)可以使外源基因以附着体形式复制，分离到子代细胞，从而使基因高效持续表达，是种新型的非病毒表达载体 。 我们构建了以EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)复制子(EBV replicon，EBVR)为基础的附着体质粒载体，并将报告基因增强型绿色

真核转染

、SHG-44-重组pcDNA3→5×104/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。③软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→104 细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。三、注意事项1、优化转染条件（脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间）每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌

进行真核转染的一般程序

细胞的正常培养。 二、操作步骤 (一)克隆目的基因 1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。 2、回收特异性扩增片段，连入T载体。 3、转化DH5α，质粒制备。 4、酶切初步鉴定，测序证实。 (二)真核重组表达载体的构建： pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生