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文献和实验【专题讨论】原核表达秘笈之宿主菌株的选择!(接原原核表达研究者关心的10个问题贴)
性不利,容易出现质粒丢失、表达水平不稳定、菌株退化乃至发生污染等情况。 我们建议: 1、长期存放菌株和pET重组子应该存在甘油-70℃保种。但是要注意高浓度甘油(>10%)会导致质粒不稳定。请尽量保持甘油浓度8%。(15%浓度的甘油保种液和新鲜菌液1:1就行)2、重组质粒不宜长期保存于表达菌株(带DE3的大肠杆菌)中,请尽量使用带有recA endA突变的克隆菌株(比如C600,DH5a)进行质粒抽提和保存质粒。表达型的菌株提质粒经常会有质量不高或者背景的问题。特别是大量抽提。
-1,pBADHis, pBADHislacZ,pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C 共表达质粒:pCDFduet-1 以及pCDNA3.1,pEGFP-N2等 大肠杆菌Rosetta(DE3),Rasettagame(DE3),Top10F', BL21(DE3)plySS 等 酵母表达质粒: pPICZαA, pGAPZαA, 酵母细胞 KM71, X33 yingzi
本月旧帖整理活动专题: T-A克隆技术 大家可以在以下基础上进行整理或对具体问题进行讨论 (1)如何筛选合适的宿主菌株 ◇ 所选的宿主菌株应对所用质粒的抗生素抗性基因敏感。 ◇ 如进行蓝/白斑筛选,宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽编码区应在染色体或附加体上缺失掉(lacZΔΜ15)。TOP10和DH5α都能用于蓝/白斑筛选。 ◇ 要表达重组蛋白,可使用带有可诱导的T7 RNA聚合酶基因的菌株,如BL21(DE3)。 ◇ 使用pGEM载体克隆大片段时(>7-8 kb),经转化
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