无内毒素质粒中提试剂盒（5～15mL）

本试剂盒通过碱裂解法裂解细胞，新型硅基质膜高效专一的结合质粒DNA，同时采用特殊的缓冲液系统和除内毒素过滤柱，有效去除内毒素、蛋白等杂质。由本试剂盒所得质粒纯度高、质量稳定，特别适用于细胞转染，同时也可用于DNA测序，PCR，基于PCR的突变，体外转录，转化细菌，内切酶消化等下游实验。

内毒素是质粒提取中常见的污染物，由于真核细胞对内毒素非常敏感，因此，如果质粒中含有内毒素会大大降低真核细胞转染效率。本试剂盒提供一种简单、快捷、高效提取无内毒素质粒的新方法，提取的质粒最大限度去除内毒素，并能有效去除基因组DNA、RNA、蛋白等污染。

试剂盒组成：

组份	50次
Buffer P1	30mL
Buffer P2	30mL
Buffer E3	30mL
Buffer PS	15mL
Buffer PW(浓缩液)	10mL
Endo-Free Buffer EB	10mL
RNase A(10mg/ml)	600μL
内毒素过滤柱FM及收集管	50套
吸附柱DL及收集管	50套

保存：室温(15～30℃)

自备试剂：无水乙醇、异丙醇。

实验前准备及重要注意事项：

• 所有组分可在干燥、室温(15～30℃)环境稳定保存1年，更长时间保存可置于2～8℃，加入RNase A的Buffer P1置于2～8℃可稳定保存6个月。


• 第一次使用前，将RNase A溶液全部加入到Buffer P1中，混匀，置于2～8℃保存，使用前需在室温中放置一段时间，恢复至室温后使用。


• 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。


• 使用前请先检查Buffer P2和Buffer E3是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀现象，可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清。


• 注意不要直接接触Buffer P2和Buffer E3，使用后应立即盖紧盖子。


• 提取质粒的量和纯度与细菌培养浓度、菌株种类、质粒大小、质粒拷贝数等因素有关。

操作步骤：

• 取5～15mL过夜培养的菌液，加入离心管(自备)中，13000rpm(~16200×g)离心1分钟收集细菌，尽量吸弃全部上清。


• 向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL Buffer P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。
  注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。


• 向离心管中加入500μL Buffer P2，温和地上下颠倒混匀8～10次，使菌体充分裂解，室温放置3～5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠。
  注意：温和混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。


• 向离心管中加入500μL Buffer E3，立即上下颠倒混匀8～10次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5分钟。13000rpm离心5分钟，吸取上清，将上清加入过滤柱FM中(已装入收集管)，13000rpm离心1分钟过滤，将收集管中的滤液转移到离心管(自备)中。
  注意：
  ① Buffer E3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。
  ② 吸附柱的最大容积为750μL，所以上清液请分两次过滤，并混合于同一自备离心管中。


• 向滤液中加入450μL异丙醇，上下颠倒混匀。


• 柱平衡：向已装入收集管的吸附柱中加入200μL Buffer PS，13000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。


• 将步骤5中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱(已装入收集管)中。


• 13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  注意：吸附柱的最大容积为750μL，所以第5步中所得溶液分多次过柱。


• 向吸附柱中加入750μL Buffer PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。


• 将吸附柱重新放回收集管中，13000rpm离心1分钟。
  注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。


• 将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附膜的中间部位加入100～200μL Endo-Free Buffer EB，室温放置2～5分钟，13000rpm离心2分钟。-20℃保存质粒。
  注意：
  ① 为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2～5分钟，13000rpm离心2分钟。Endo-Free Buffer EB在65～70℃水浴预热，适当延长吸附和洗脱的时间，可以增加提取效率。
  ② 质粒拷贝数较低或>10kb时，Endo-Free Buffer EB在65～70℃水浴预热，可以增加提取效率。