线粒体和胞浆蛋白制备试剂盒 C1260 厂家直销，提供OE

描述：线粒体/胞浆制备试剂盒 (Mitochondria Isolation Kit)用于从组织或培养细胞中分离线粒体和细胞胞浆成分。加入分离溶液，匀浆破碎组织细胞，经过数次800g和12000g离心，在60分钟内即可分离出完整的线粒体和胞浆成分。制备的线粒体具有很高的生物学活性，可进行各种功能研究如酶学测定，更可用于Western Blot、2D-胶、线粒体蛋白或DNA提取、蛋白质组学等研究。

严格按照说明操作，总是能制备获得高纯度线粒体。一篇方法学研究论文发现，用普利莱试剂盒制备线粒体的得率、活性、纯度优于蔗糖密度梯度离心法和Invotrogen/Pierce线粒体提取试剂盒方法。

适用：从组织、培养细胞制备高纯度线粒体，同时分离细胞胞浆成分。

组成：Mito Solution    100 ml for 50 次制备
200 ml for 100 次制备

储存： −20 ºC  12个月有效

操作步骤：
以下所有操作均在4 ºC进行

1. 组织匀浆：100~200 mg新鲜组织如肝、脑、肾、心肌等，剪为0.5cm²碎块放入小容量玻璃匀浆器内。估计组织块总体积。加入1.5 ml冰预冷的Mito Solution。用间隙严紧的研杵上下研磨组织20次。

培养细胞匀浆：800 × g 5 min离心收集细胞。单次提取需2-5 × 10⁷个细胞。加入1.5 ml冰预冷Mito Solution重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，用间隙严密的研杵研磨细胞30次。

1. 将匀浆液转移到离心管中，800 × g ，4 ºC离心5 min。（胞核、膜碎片、未裂解细胞等在管底，弃去）
2. 收集上清液并转移到新的离心管。再次800 × g 离心5 min at 4 ºC，弃沉淀。
3. 将上清液转移到新的离心管。10,000 × g 离心10 min 4 ºC。线粒体沉淀在管底。离心后的上清含胞浆成分，可收集用于对照实验。
4. 洗涤线粒体：加入0.2 ml Mito Solution，轻弹管底重悬线粒体沉淀；12,000 × g 离心10 min 4 ºC。弃上清，线粒体沉淀在管底。
5. 重悬线粒体：可以用Mito Solution重悬线粒体沉淀，也可以用合适后续实验的自备缓冲液来裂解线粒体沉淀，具体用量是：约每100 mg组织提取的线粒体用50 µl，约每5 × 10⁷个细胞提取的线粒体用100 µl。用量请根据组织或细胞类型进行微调。
6. 裂解线粒体后，进行蛋白浓度测定。立即使用或−70 ºC保存。

说明：

1. 制备高质量线粒体的关键：第一，全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中；第二，快速，微量制备比大规模制备操作更快速，更容易获得完整的线粒体，且得率高；第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。破碎效果与组织细胞类型有关；与组织块相比，贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁。用1-3 ml小容量玻璃匀浆器(而不是其它破碎装置)上下研磨培养细胞20-30次。玻璃匀浆器须配套选用间隙严密的研杵，其特征是将研杵插入匀浆器套管后，可提起研杵而套管不会脱落。正确的匀浆不是旋转研杵，而是上下缓慢推拉研杵，研杵推进和提升过程中细胞遭受压力的剧变而破碎。研磨程度可用相差显微镜进行检查当未裂解细胞在~50%即可。过度研磨会破坏线粒体，而研磨不足将降低线粒体得率。
2. 如果不得不用电动匀浆器(polytron)，可选用6500转，刀头上下进出4次共计10秒。不同的电动匀浆器性能差别甚大，除非步步监测，否则分离结果难以预料。
3. 不同的离心机必须跟据离心力g计算正确的离心转速(允许10%波动)，否则将导致不纯。
4. 进行Western Blot可直接用RIPA裂解液或SDS-PAGE样品缓冲液裂解线粒体；也可先用Mito Solution重悬线粒体，再加入2x SDS-PAGE样品缓冲液。
5. Cytochrome oxidase, Monoamine oxidase, Succinate dehydrogenas, Glutamate dehydrogenase可用作线粒体的标志酶。
6. 重悬线粒体：可以用Mito Solution重悬线粒体沉淀，也可以用合适后续实验的自备缓冲液来裂解线粒体沉淀具体用量是：约每100 mg组织提取的线粒体用50 µl，约每5 × 107个细胞提取的线粒体用100 µl。用量请根据组织或细胞类型进行微调。
7. 裂解线粒体后，进行蛋白浓度测定。立即使用或−70 ºC保存。

发表英文论文时可供参考的书写方式：Mitochondria Isolation Kit was purchased from Applygen Technologies Inc. (Beijing, China)

发表中文论文时可标明：线粒体/胞浆制备试剂盒购自北京普利莱基因技术公司

目前，使用我公司线粒体/胞浆蛋白制备试剂盒发表的SCI英文论文已有多篇，以下供参考：
 

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