磷酸化蛋白富集试剂盒北京品牌

特别提示：包括磷酸化蛋白富集试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：磷酸化蛋白富集试剂盒
英文名称：Phosphorylated protein enrichment Kit
产品货号：HR0015
产品规格：50T|100T

磷酸化蛋白富集试剂盒是利用磷酸基团与金属的亲和力，采用固定化金属螯合层析(IMAC)的方法富集磷酸化蛋白。可以选择性的对磷酸化蛋白和多肽进行富集和纯化。本试剂盒可以用来提取富集哺乳动物细胞、组织、细菌、酵母、植物等样本的的磷酸化蛋白。
经本试剂盒制备的蛋白样品可用于Western blotting,mass spectrometry,2D-PAGE和protein arrays等下游应用。

储存条件：蛋白酶磷酸酶抑制剂-20℃保存；其它2-8℃保存。蛋白柱室温避光保存。
有效期：一年。

注意事项：
●本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。

试剂盒以外自备试剂和仪器：
● 移液器、吸头 ●离心机及离心管
● 涡旋振荡器 ●冰箱，冰盒

使用方法：

使用注意事项：
1．旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
2．实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
3．蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
4．蛋白样品中不可含 EDTA。
5．上样蛋白样品 pH 值必须低于6，蛋白浓度在0.25-0.5mg/ml。
6．洗涤细胞和组织是不能用 PBS等磷酸盐缓冲液，要用非磷酸盐缓冲液，如50mM HEPES，Tris等或生理盐水。
7.可以根据自己实验需要加入其它磷酸酶抑制剂单品。
8．用蛋白柱进行磷酸化蛋白富集，需要离心操作时将蛋白柱置于一个 50ml离心管离心即可。
9．最终蛋白样品用于 2D电泳前需脱盐。
一、蛋白样品的准备：
以下为由细胞和组织制备蛋白样品的参考步骤，其它方法得到的蛋白样品稀释至蛋白浓度为0.25-0.5mg/ml 后直接上样即可，确保蛋白样品的pH 值低于6。
可以用试剂盒中的洗柱液、裂解液、洗涤液稀释蛋白样品。
细胞裂解：
1．提取液制备：每 500μl冷的裂解液中加入2μl蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2．取5-10×106个细胞，在4℃，1000rpm条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
3．用冷生理盐水洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4．每 5×106个细胞中加入500μl冷的蛋白裂解液，混匀后，在4℃条件下振荡15-20分钟。
5.在 4℃，14000rpm条件下离心15分钟。
6．快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白裂解液。
组织裂解：
1．提取液制备：每 500μl冷的裂解液中加入2μl蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2．取100mg组织样本剪碎，加入总蛋白提取液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。
3．将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在4℃，10000rpm条件下离心5分钟。
4．将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白裂解液。
植物蛋白提取：
1．裂解液制备：每500μl冷的提取液中加入2μl蛋白酶磷酸酶抑制剂，混匀后置冰上备用。
2．取200mg植物组织样本，去除粗筋脉络等后剪碎，置于研钵中用液氮研磨。(没有液氮也可直接置冰上研磨即可)
3．研磨后加入 500μl提取液，混匀后于一个预冷的干净离心管中在冰上静置2-3小时。
4．在 4℃，12000rpm以上条件下离心10-15分钟。
5．将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。
细菌蛋白提取：
注：细菌中磷酸化蛋白量较少，请根据样本情况调整所需的样本量。经过基因工程改造的可以直接合成表达磷酸化蛋白的细菌样本，根据情况处理细胞，不一定按下面的步骤。

1．裂解液制备：每500μl冷的提取液中加入2μl蛋白酶磷酸酶抑制剂，混匀后置冰上备用。
2．在 4℃ 12000RPM条件下将菌液离心5min，弃上清，尽量吸干剩余液体，收集菌体，用生理盐水洗菌体2次。若为冷冻菌体直接进行下面操作步骤即可。
3．按每 20mg湿重菌体样本加入500μl裂解液，吹打混匀，冰上放置20-30分钟。
4．300w，10s超声/10s间隔条件下冰浴超声至菌液变清。
5．在 4℃ 12000RPM条件下将菌液离心5分钟，将上清移入冷的干净离心管。
6．即得到细菌总蛋白样品。
二、柱平衡：
加入 500μl 洗柱液洗柱，重力作用下或4℃下1000g 力离心1分钟甩干吸附柱。
三、上样：
将以上蛋白裂解液或其它待富集蛋白样品加入吸附柱，重力作用下或4℃下1000g力离心1分钟甩干吸附柱。
四、洗柱：
加入300μl洗涤液洗柱，重力作用下或4℃下1000g力离心1分钟甩干吸附柱。重复两次。
五、洗脱：
加入500μl磷酸化蛋白洗脱液，重力作用下或4℃下1000g力离心1分钟甩干吸附柱，收集洗脱液，即得到磷酸化蛋白。
六、柱保存和柱再生：
磷酸化蛋白纯化柱如果保存和处理得当的话可以多次重复使用。
使用后可以用1ml 0.1M EDTA溶液洗柱，然后在柱中加入20%乙醇溶液密封，置2-8℃保存。
加入0.1M氯化tiě溶液，浸泡蛋白柱填料，即可对蛋白柱进行再生。

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