Real Time PCR预混试剂（染料法,含指示剂)(40

特别提示：包括Real Time PCR预混试剂（染料法,含指示剂)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：Real Time PCR预混试剂（染料法,含指示剂)
英文名称：SuperReal PreMix Color（SYBR Green)
产品货号：WH0107
产品规格：125次|500次|5000次

本制品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。产品中预先混有Real Time PCR反应所需最适浓度的SYBR Green I，是一种2×浓度的PreMix。产品额外添加了指示剂，利于大量样品的加样，减少误操作概率。

SuperReal Color PreMix采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶（化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶），配合精心优化buffer体系，具有高扩增效率，高扩增特异性和宽广的可信范围的特点。本升级版试剂在经过成分调整后，扩增特异性上的优势更为突出。

产品特点：
1.SuperReal Color PreMix采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶（化学修饰的HotStar TaqDNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶)，从而构成酶活自动调节系统，配合精心优化buffer体系，具有高扩增效率，高扩增特异性和宽广的可信范围的特点。
2.本产品Buffer体系平衡了K+和NH4+的比例，还特别添加了独特的H-Bond因子,能协同调整反应体系中的氢键作用力，使引物模板退火条件更加严谨，反应的专一性增强，重复性更好。
3.SuperReal Color PreMix中预混有SYBR Green I，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、无RNA酶超纯水便可进行Real Time PCR反应，操作简单方便。
4.本产品附带ROX Reference Dye，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，方便客户针对不同型号荧光定量PCR仪时选择对应浓度使用。
5.添加颜色指示剂，令加样更加简便，有效降低误操作概率。经过严格检测，指示剂不会影响染料的荧光值和定量结果。


试剂盒原理：
本产品采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶进行PCR扩增，通过检测反应进程中SYBR Green I的荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。

本产品中双热启动酶构成了独特的酶活自动调节系统。酶活自动调节系统是由化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶组成。其中HotStar Taq DNA聚合酶占绝大部分比例，其聚合酶活性的激活是严格依赖于95℃高温的一个缓释过程，而Anti Taq DNA聚合酶则在95℃高温下完全激活。经过95℃条件下孵育15min激活大部分HotStarTaq DNA聚合酶，进入PCR循环后，每经过一轮95℃条件下变性，即可重新激活一部分HotStar Taq DNA聚合酶。HotStar Taq DNA聚合酶独特的酶活缓释机制使其可以与Anti Taq DNA聚合酶构成独特的酶活自动调节系统。PCR反应初期，完全激活的Anti Taq DNA聚合酶可以协同已经激活的HotStar Taq DNA聚合酶达到最佳酶活状态，而在整个PCR反应过程中，每一轮新释放的HotStart Taq DNA聚合酶活力刚好可以弥补因热变性所导致的部分酶活损失。因此，SuperReal Color PreMix在整个PCR反应过程始终保持最佳的DNA聚合酶活力，配合精心优化Buffer体系，从而可以获得高扩增效率，高扩增特异性和更加广泛性的模板适应性。

试剂盒组成：

组分	20μl×125次	20μl×500次	20μl×5000次
2×SuperReal Color PreMix	1.25ml	4×1.25ml	40×1.25ml
50×ROX Reference Dye	250μl	1ml	10×1ml
40×样本稀释液（黄色)	1.25ml	1.25ml	10×1.25ml
RNase-Free ddH2O	2×1ml	5×1ml	50×1ml

储存条件：收到本产品后，请立即置于-20℃避光保存。从-20℃取出使用时，将冻存的2×SuperReal Color PreMix和50×ROX Reference Dye融解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用，须彻底混匀后重新冷冻（在解冻过程中盐会出现分层现象，未混匀进行冷冻，盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用，可在2～8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。

注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1．PCR反应液中各颜色指示剂的终浓度应为1×，请根据模板的添加量计算Dilution Buffer的用量
2．PCR反应的预变性条件必须设定为95℃ 15min，用以充分激活热启动酶。
3．本产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
4．如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀，请不要使用涡旋仪进行混匀，尽量避免出现泡沫，并经瞬时离心后使用。
5．引物终浓度为0.3μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。如果需要进一步优化，可以在0.2-0.5 μM范围内调整引物浓度。
6．20μl反应体系中，基因组DNA或cDNA模板的使用量一般小于100ng，逆转录产物作为模板时，使用量应不超过PCR体系终体积的20%。

进行RT-qPCR反应时的操作建议：
进行RT-PCR反应时，有两种cDNA第一链合成试剂盒可以选择，分别是QuickQuant cDNA第一链合成试剂盒（WH0098)和BaiScript II cDNA第一链合成试剂盒（WH0099)。其中QuickQuant cDNA第一链合成试剂盒是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的，具有高灵敏度的RT-PCR反应系统，可以从极低量的总RNA或poly （A)+ RNA合成第一链cDNA。该试剂盒中使用的逆转录酶Quant Reverse Transcriptase与通常使用的Moloney鼠白血病病毒来源的M-MLV和鸟成髓细胞病毒来源的AMV不同，是一种使用大肠杆菌工程菌进行重组表达的全新高效逆转录酶。该酶能够高效转录多种RNA模板，最大限度将RNA转录成cDNA第一链。

操作步骤：

一、建立Real-Time PCR反应体系：
请注意将2×SuperReal Color PreMix和50×ROX Reference Dye避光保存。

1．解冻2×SuperReal Color PreMix （如果保存在-20℃)，50×ROX Reference Dye，模板，引物、40×Dilution Buffer和RNase-Free ddH2O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀。
2．建议置于冰上进行Real Time PCR反应液的配制。
  40×Dilution Buffer为黄色，2×SuperReal Color PreMix为蓝色。如需稀释模板，则最终反应体系应为绿色；否则应为蓝色。如颜色不符，请检查体系中是否正确加入相关组分。反应体系：

成分	50μl体系	25μl体系	20μl体系	终浓度
2×SuperReal Color PreMix	25μl	12.5μl	10μl	1×
正向引物（10 μM)	1.5μl	0.75μl	0.6μl	0.3μM①
反向引物（10μM)	1.5μl	0.75μl	0.6μl	0.3μM①
cDNA模板②	-	-	-
50×ROX Reference Dye③	-	-	-	-
RNase-free ddH2O	至50μl	至25μl	至20μl	-

①引物终浓度为0.3μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发生非特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的，可以在0.2～0.5 μM范围内调整。
②如需稀释模板，应先将cDNA模板与40×Dilution Buffer按一定比例混合成稀释模板。稀释比例如下：
 20μl反应体系中cDNA用量与40×Dilution Buffer含量对应表：

20μl PCR体系中稀释 模板的添加量	1μl	2μl	2.5μl	3μl	4μl	5μl	6μl
稀释模板中Dilution Buffer的浓度	20×	10×	8×	6.7×	5×	4×	3.3×
100μl稀释模板中所需 40×Dilution Buffer的量	50μl	25μl	20μl	16.7μl	12.5μl	10μl	8.4μl
100μl稀释模板中所需 cDNA的量	50μl	75μl	80μl	83.3μl	87.5μl	90μl	91.6μl

 50 μl反应体系中cDNA用量与40×Dilution Buffer含量对应表：

50μl PCR体系中稀释 模板添加量	2μl	2.5μl	3μl	4μl	5μl	6μl	8μl
稀释模板中所需 Dilution Buffer的浓度	25×	20×	16.7×	12.5×	10×	8.3×	6.25×
100μl稀释模板中所需 40×Dilution Buffer的量	62.5μl	50μl	41.7μl	31.3μl	25μl	20.8μl	15.6μl
100μl稀释模板中所需 cDNA的量	37.5μl	50μl	58.3μl	68.7μl	75μl	79.2μl	84.4μl

③几种常见仪器的最适ROX Reference Dye浓度如下：
 ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/StepOne等：5×（例如5μl ROX/50μl体系)
 ABI 7500、7500 Fast；Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等：1×（例如：1μl ROX/50μl体系。
 Roche仪器，Bio-Rad仪器，Eppendorf仪器等：无需添加。

二、进行Real time PCR反应：
建议采用两步法PCR反应程序进行反应。当出现模板浓度过低引起非特异扩增，引物Tm值较低导致的扩增效率低下或扩增曲线重现性不佳等现象时，建议尝试进行三步法PCR扩增反应。

两步法反应程序：

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	15min	预变性	否
PCR反应	40×	95℃	10sec	变性	否
		60-66℃①	20-32 sec②	退火/延伸	是
熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）

三步法反应程序：

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	1min	预变性	否
PCR反应	40×	95℃	5sec	变性	否
		50-60℃①	10sec	退火	否
		72℃	15sec②	延伸	是
熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）

①请先使用60℃ 32 sec （20 sec,30 sec,31sec.)进行扩增。如果需要进一步优化，可以尝试在60-66℃范围内进行。
②使用不同型号仪器进行时间设定时，请按照仪器使用说明书要求进行实验操作，几种常见仪器的时间设定如下：
 使用ABI 7700/7900HT/7500 Fast，Roche，BioRad和Agilent等公司荧光定量PCR仪时请设定在15 sec。
 使用ABI 7000和7300时请设定在31 sec。
 使用ABI7500时请设定在32 sec。
③通常引物退火温度比引物的解链温度（Tm)低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度。

3．盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有组分均在管底。
4．将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应。

引物设计说明：
进行Real Time PCR反应时，PCR引物的设计非常重要。设计PCR扩增效率高，反应特异性强的引物可以参考以下要求。
1．引物长度：18-30个碱基。
2．GC含量：40-60%
3．Tm值：引物软件都可以给出Tm，与引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度也有关。上下游引物的Tm值要尽量接近。简单的Tm计算公式为：Tm = 4℃（G + C)+ 2℃（A + T)。一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。提高退火温度可以增加PCR反应的特异性。
4．PCR扩增产物长度最好在100-150 bp之间。尽量避开在模板的二级结构区域设计引物。避免上下游引物3"端之间形成2个或以上的互补碱基以减少引物二聚体的形成。引物3"端碱基不能有多于3个连续的G或C。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构。避免引物3"末端碱基为T。引物序列中A、T、G、C要尽量均匀分布。

常见问题：

1．无扩增信号或扩增曲线起峰晚或仅有引物二聚体

原因	解决办法
DNA模板中存在抑制剂	重新纯化模板或降低模板使用量
Mg2＋浓度不合适	使用2×SuperReal Color PreMix时，PCR反应体系中Mg2＋的终浓度为2mM。对有些扩增体系，可以将Mg2＋终浓度提高到5 mM。进行Mg2＋终浓度优化时，建议每次增加0.5 mM Mg2＋浓度进行实验。
加样错误或试剂问题	检查试剂浓度和保存条件，包括所使用的引物和模板。重复进行实验。
热启动酶未能激活	使用试剂时，请确保预变性条件为95℃ 15min，用以有效激活热启动DNA聚合酶。
PCR条件、引物序列或浓度不当	请确认引物未发生降解，引物浓度及PCR条件，扩增不好时，通常先尝试降低退火温度，延长退火时间和提高引物浓度，有时也可以提高退火温度，增加延伸时间，降低升温速度。对于GC含量高的模板，可以适当延长变性时间。如果还是扩增不好，请重新设计引物。
起始模板问题	检查起始模板的浓度，保存条件和质量。重新对模板进行线性梯度稀释，并用新稀释模板进行实验。增加起始模板使用量。

2．NTC出现较高的荧光值

原因	解决办法
试剂污染	建议使用新试剂进行实验。
PCR反应液配制时发生污染	采取必要的防污染策略（如使用带滤芯的枪头)。
引物出现降解	可以使用变性聚丙xī酰胺胶检测引物降解情况。

3．出现引物二聚体和（或）非特异扩增

原因	解决办法
Mg2＋浓度不合适	使用2×SuperReal Color PreMix的反应体系含有Mg2＋的终浓度为2mM。对有些扩增体系，可以将Mg2＋终浓度增加到5 mM。建议每次增加0.5 mM Mg2＋浓度进行优化。
PCR退火温度太低	建议每次增加2℃进行退火温度优化。
引物设计不合适	考虑重新设计引物序列。
PCR产物太长	荧光定量PCR产物长度最好在100-150 bp之间，而且不应该超过500 bp。
引物出现降解	可以使用变性聚丙xī酰胺胶检测引物降解情况。
计量误差	反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。

4．定量值重现性差

原因	解决办法
仪器方面的故障	因为仪器的不适用，在温度管理或检测时产生重现性差。请根据相应仪器的说明书进行点检。
样品纯度不好	不纯的样品会导致实验的重现性差。
稀释的模板放置太久	通过梯度稀释的模板最好现配现用。
引物质量下降	尽量避免新合成引物批次间的差异，可以使用原来质量好的引物做为对照。
PCR反应条件、引物浓度、序列等不恰当	扩增效率差的PCR较容易产生重现性差。通过变更引物的度或PCR反应条件来进行调整。扩增不好时，一般可降低退火温度或提高引物浓度，也可以延长延伸时间。如模板的GC含量较高，可延长变性时间。仍得不到改善时，建议重新设计引物。
计量误差	反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。

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