总RNA抽提试剂（Trizol法）

本试剂是一种用于动植物细胞或组织及细菌总RNA抽提的试剂。本产品采用和Invitrogen公司的TRIzol完全相似的原理和方法，抽提的方法和步骤完全相同。本试剂的颜色和TRIzol相同，加入氯仿后上层呈无色，下层呈紫红色，便于吸取上层水相。

本试剂可以抽提长达15 kb的RNA，也可以抽提microRNA等小RNA。抽提小RNA时宜-70℃沉淀过夜。抽提所得RNA无DNA和蛋白污染。一般所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值为1.8-2.0。裂解细胞或和组织共匀浆时，本试剂可以保持样品中RNA的完整性，即可以有效抑制RNA的降解。每一百万细胞用本试剂抽提可得5-15μg RNA；每毫克组织用本试剂抽提可得1-10μg RNA。产量因细胞和组织不同而异。每100ml本试剂可以抽提100个六孔板中的样品或100个50-80mg的组织样品。抽提两个样品约需一小时。

本试剂抽提所得RNA可直接用于Northern，点杂交，纯化mRNA，体外翻译，RNase protection assay，cDNA克隆，以及RT-PCR；也可以用于基因表达芯片分析、高通量测序等对RNA质量要求较高的情况。

我公司的BalbZol(货号：YT526)和Trizol(货号：YT527)的成分有细微差别，实际抽提效果无任何显著差异。

注意事项：

• 本制品可4℃保存，有效期一年。


• 需自备氯仿，异丙醇，DEPC，75%乙醇(DEPC水配制)，和DEPC水。DEPC水(YT528)可向百奥莱博订购。


• 所有离心管，枪头及相关溶液都必须无RNA酶污染。耐高温器物可150℃烘烤4小时以去除RNA酶，其它器物去除RNA酶可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。加0.01%(体积比) diethylpyrocarbonate(DEPC)至重蒸水或Milli-Q级水中，处理过夜，灭菌即成DEPC水。


• 使用冻存的细胞或组织抽提总RNA的效果通常比新鲜的细胞或组织差一些。因为在细胞或组织冻融过程中一些细胞或组织内的RNase会被释放出来并剪切样品。如果不能及时抽提RNA，推荐先加入适量本试剂，并裂解样品后冻存。


• 必须戴一次性手套操作，且尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。建议戴一次性口罩操作。


• 本试剂含有毒物质苯酚，避免接触皮肤或吸入。为防止溅入眼睛，请戴防护眼镜或使用透明保护屏。如皮肤接触本试剂，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。


• 本试剂抽提总RNA的同时，理论上也可抽提蛋白和DNA，但未经测试。有兴趣者可按Invitrogen公司的TRIzol的操作步骤进行操作。

使用说明：

• 细胞裂解或组织匀浆。
  • 贴壁细胞
    吸尽培养液，每10平方厘米细胞加入1ml BalbZol。一般六孔板每孔加1ml BalbZol，12孔板每孔加0.5ml BalbZol。晃动3-5下，再用枪吹打2-3下，确保全部裂解，然后吸至离心管中。
  
  
  • 悬浮细胞
    离心收集细胞，吸尽液体，每五百万至一千万动植物或酵母细胞，或一千万细菌，加入1mlBalbZol。用枪吹打或适当vortex，确保全部裂解。某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，确保全部裂解。
  
  
  • 组织
    先将组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内。每50mg-80mg组织加入1ml BalbZol，匀浆。对于RNA完整性要求比较高的情况，推荐先液氮冷冻组织块，然后在低温下用研钵研碎组织，随后再加入BalbZol进行总RNA抽提。


• 对于某些蛋白，多糖或脂含量很高的细胞或组织，BalbZol裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物。需12,000g 4℃离心10分钟，然后吸取澄清的BalbZol裂解产物至一新的离心管中。


• 室温放置5分钟，使样品充分裂解。


• 每毫升BalbZol加入0.2ml氯仿，vortex混匀或猛烈晃动15秒，室温放置2-3分钟。


• 12,000g 4℃离心15分钟，然后吸取含总RNA的上层无色水相至一新的离心管中，每毫升BalbZol约可吸取0.5-0.55ml。


• 按每毫升最初的BalbZol加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。如果希望提取microRNA等小RNA，推荐-70℃沉淀过夜。


• 12,000g 4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀，弃上清。


• 每毫升最初的BalbZol加入1ml 75%乙醇(DEPC水配制)，vortex或颠倒混匀。


• 7,500g 4℃离心5分钟，弃上清。再用离心机甩一下（>5,000rpm，离心1秒），小心吸尽液体。


• 待RNA略干后，加入20μl DEPC水溶解，-70℃冻存。
  注意：切勿让RNA过分干燥，否则将极难溶解，且测出的A260/280值会低于1.6。