高纯质粒少量提取试剂盒北京厂家

特别提示：包括高纯质粒少量提取试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：高纯质粒少量提取试剂盒
英文名称：High Purity Plasmid mini Extraction Kit
产品货号：WH0035
产品规格：50次

本试剂盒在离心柱型质粒提取试剂盒基础上，增加了本公司特制的过滤柱CS，可在提取质粒的同时去除痕量蛋白及其它杂质，提取的高纯度质粒DNA可多至70μg，适用于需较大量质粒的动物细胞转染等高精度分子生物学实验。

产品特点：
·高纯度：提取的质粒DNA可直接用于转染等高要求实验。
·快速：步骤少，操作简单，节省时间。
·高 效：可提取菌体85%以上质粒DNA。

质粒得率：

质粒类型	处理量	得率	质粒
高拷贝质粒	5-15ml	15-70μg	pTZ,pUC,pBS,pTG-T
低拷贝质粒	5-15ml	5-25μg	pBR322,pACYC及其衍生载体pSC101 及其衍生载体，SuperCos,pWE15

试剂盒组成：

组分	50T
平衡液BL	30ml
溶液P1	30ml
溶液P2	30ml
溶液P3	40ml
去蛋白液PD	30ml
漂洗液PW	15ml
洗脱缓冲液TB	15ml
RNaseA（10mg/ml)	300μl
过滤柱CS	50个
吸附柱CP4	50个
收集管（2ml)	100个

保存条件：室温（15-25℃)干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于2-8℃。2-8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应先将试剂盒内的溶液在室温中放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10min以溶解沉淀。单独包装的RNase A在室温可稳定保存12个月。加入RNase A和BaiRed后的溶液P1应置于2-8℃保存，可稳定保存6个月。

注意事项：（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项)
1．溶液P1在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀，置于2-8℃保存。
2．使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
3．注意不要直接接触溶液P2和P3，使用后应立即盖紧盖子。
4．所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心，速度为12000rpm （~13400×g )。
5．提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液应在65-70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。
6．实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以zuì大限度激活硅基质膜，提高得率。
7．用平衡液BL处理过的柱子zuì好当天使用，放置时间过长会影响效果。

使用方法：
使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

1．柱平衡步骤：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12000rpm（~13400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
2．取5-15ml过夜培养的菌液加入离心管中，12000rpm （~13400×g )离心1 min，尽量吸除上清。
  注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中,菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。
3．向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1 （请先检查是否已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
  注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
4．向离心管中加入500μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
  注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
5．向离心管中加入700 μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm （~13400×g )离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。
  注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
6．将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），12000rpm（~13400×g )离心2 min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中），（如果过滤柱中有残余的液体说明步骤5吸取的上清中杂质过多，可以延长离心的时间；如果离心后收集管底部有少量的沉淀，尽量地吸取上清）。
7．12000rpm （~13400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
8．向吸附柱CP4中加入500μl去蛋白液PD，12000rpm （~13400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
9．向吸附柱CP4中加入600 μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
  注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。
10．重复操作步骤9。
11．将吸附柱CP4重新放回收集管中置于12000rpm （~13400×g )离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
  注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
12．将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300 μl洗脱缓冲液TB，室温放置2 min，12000rpm （~13400×g )离心1 min将质粒溶液收集到离心管中。
  注意：洗脱缓冲液体积不应少于100 μl，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解，洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2 min，12000rpm（~13400×g )离心2 min，将质粒溶液收集到离心管中。

质粒DNA浓度及纯度检测：
1．得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为单一条带，也可能为2到3条DNA条带，这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。OD₂₆₀值为1相当于大约50 μg/ml双链DNA。
2．OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddH2O，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。

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