AO/PI 染液(acridine orange / pro

对病毒的研究已经从疾病研究扩展到疫苗、抗病毒药物和癌症治疗等方面。在病毒疫苗的研究中，一种新型流感减毒活疫苗已在临床试验中已被证明可诱导血清和粘膜抗体交叉中和不匹配的流感病毒株。在疫苗开发中，病毒滴度实验和抗体中和试验通常是对单层宿主细胞上用结晶紫或H&E染色的病毒蚀斑进行手工计数。但人工计数耗时长，而且人为的主观差异大。为了提高产量、精度和灵敏度，宿主细胞可以铺在96孔板上被病毒感染，病毒颗粒可以用荧光蛋白或抗体来标记，用荧光灶斑分析。然而，由于荧光显微镜的局限只能观测到孔内小面积的细胞图像，造成荧光灶斑计数的不准确性限制。因此，减毒活疫苗的生产需要基于病毒滴定实验和抗体中和试验的高通量和多孔板全孔分析。

 

在这项工作中，我们使用Celigo细胞成像分析仪演示了一种高通量灶斑计数方法。首先，将病毒颗粒从1:5稀释至1:512，以感染96孔板中的Vero细胞。随后，用甲型流感抗体（Influenza A NP）和标记Dylight-488的二抗对细胞进行固定和染色。利用Celigo获取明场和荧光全孔图像，直接对孔内的灶斑计数。此外，抗体中和试验需将固定数量的病毒与不同滴度的血清样本预先孵育1小时后进行。然后，细胞被感染24小时后再进行荧光染色和分析。对于不同滴度下的灶斑计算，Celigo和荧光显微镜是有可比性的。使用高通量细胞分析计数方法，病毒滴度实验、抗体中和实验和TCID50实验等可以微孔板的全孔成像，从而高效完成实验检测，并可在更早的时间点以更高的准确性和可重现性进行操作，并极大地促进了新型疫苗和抗病毒药物的快速高效开发。

细胞成像分析仪CELIGO的病毒学检测

Celigo是一种基于多孔板的自动化细胞成像分析仪，能够高通量明场全孔扫描和4个荧光通道全孔扫描。Celigo的病毒学模块会自动分析图像，量化计数，大小，形态和荧光强度，并生成有关细胞增殖，荧光表达，细胞毒性，病毒滴度的灶斑计数和抗体中和测定的报告。

直接计数病毒蚀斑-细胞成像分析法

 

Celigo采用全孔成像且明场分辨率为1µm。Celigo软件对明场中的病毒蚀斑进行了去集簇，识别（填充图像）和报告（热图图像）。蚀斑的数量，形态和大小会自动定量。   

病毒滴度检测-荧光灶斑计数

血清依赖性中和分析-明场计数

 

对96孔板中的单层宿主细胞ARPE-19进行HCMV血清依赖性中和测定。感染细胞被HRP标签的抗体标记。Celigo对整板全孔成像，并直接对每个孔中HRP标记的感染细胞进行计数。然后这些计数结果可用于确定每种测试血清的浓度依赖性的中和曲线。    

抗体中和实验–荧光细胞计数

Celigo分析抗H3N2 Clade 3C.2a血清和抗H3N2 Clade 3C.3a血清的抗体中和实验。该血清用于中和14种不同效价的病毒。Celigo对每个孔中的灶斑进行了计数，每个孔的成像和分析时间约10分钟。结果表明，这两种血清对14种不同病毒显示出不同程度的中和作用。

TCID50实验–明场和GFP阳性细胞计数

总结与结论

• Celigo可进行全孔高通量成像，96孔板全孔整板明场/荧光灶斑扫描和分析<10min，且兼容不同自动化设备。

• 传统测定和手动计数的测定都是基于6孔板，该Celigo方法可小型化以节省材料（96或384孔），并可在较短的孵育时间后自动进行测定。

• 上文提到的方法可以大大提高为疫苗开发或生产，提高标准病毒学检测的准确性和效率，同时降低材料成本。