隐孢子虫通用染料法荧光定量PCR试剂盒

隐孢子虫通用染料法荧光定量PCR试剂盒
Cryptosporidium spp. SYBR qPCR Kit

产品及特点
隐孢子虫(Cryptosporidium)为体积微小的球虫类寄生虫，广泛存在多种脊椎动 物体内，寄生于人和大多数哺乳动物的主要为微小隐孢子虫(C. parvum)，引起隐孢子 虫病(cryptosporidiosis)，是一种以腹泻为主要临床表现的人畜共患性原虫病，因此对 隐孢子虫进行快速灵敏的诊断具有重要的意义。本产品就是根据隐孢子虫 rRNA 编码基 因的保守区设计引物而开发的高灵敏荧光定量 PCR 产品。本试剂盒具有下列特点：
1. 根据隐孢子虫 OWP（oocyst wall protein）编码基因保守序列设计的专一性引物，
与其他肠道疾病病原体（如 B.hominis、E.coli、E.dispar、E.moshkovskii、
V.cholerae 等）无交叉反应。
2. 灵敏度比常规 PCR 高 2-3 个数量级，可以达到几十拷贝/反应。
3. 即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。
4. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。
5. 本试剂盒足够 100 次 20uL 反应体系的荧光定量 PCR。
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。 

编号	成分	规格
试剂一	2×qPCR MagicMix	0.5 mL（装 A 袋）
试剂二	超纯水	1 mL（装 A 袋）
试剂三	隐孢子虫 PCR 引物 F	0.5 OD（装 B 袋）
试剂四	隐孢子虫 PCR 引物 R	0.5 OD（装 B 袋）
试剂五	隐孢子虫基因阳性对照 (1×10E8 copy/μL)	50 μL（装 C 袋）
	使用手册	1 份

运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期一年。 
自备试剂 DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。
使用方法 一、样品 DNA 的制备
1. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数原虫 DNA 提取试剂盒兼
容。本公司的柱式粪便 DNA 提取试剂盒也可以用于隐孢子虫 DNA 提取。
二、引物的制备（在样品制备室进行）
2. 按引物标签提示在装引物干粉的管中直接加入适量的超纯水（加入量见引物试管上
的标签），使得两条引物的浓度均为 10μM（10pmol/μL），然后各取 110μL 混
合在一起得 220μL，标注为引物混合物，放冰上待用。220μL 足够 100 次 qPCR
反应。
三、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，
因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成
分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，
只提供可以直接使用的长为 150bp 的 DNA 片段作为阳性对照。
3. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
4. 用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（最好用带芯枪头，下同）。
5. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得
1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，
充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 换枪头，从 6 号管中取 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震
荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
8. 换枪头，从 5 号管中取 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照到 4 号管中，得
1×10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
9. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）
10. 在 PCR 管中加入下列成分（待测样品需要做三次重复，下表只列出一次。样品管
和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子
储存好后最后加）：
 

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性 对照管	PCR阳性对照管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix	10μL	10 μL	各 10 μL
引物混合物	2 μL	2 μL	各 2 μL
自备 10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
待测样品 DNA 模板	1-5 μL	-	-
阳性对照（2-7 号）	-	-	各 5μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）
补水到	20 μL	20 μL	20 μL

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。 

过程	温度	时间
预变性	95℃	3 分钟
PCR 反应 （45 个循环）	95℃	30 秒
	55℃	30 秒
	72℃	30 秒

12.数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时，最大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的最大吸收光谱在 500 nm，最大发射光谱在 530 nm。



四、数据处理
13. 以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品 的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。