犬细小病毒探针法荧光定量PCR试剂盒
Canine Parvo Virus(CPV)
产品及特点
犬细小病毒(Canine Parvoirus,CPV)在分类上属细小病毒属细小病毒科, 是一种单链 DNA 病毒。CPV 是感染犬、猫、狼、狐等动物并引起细小病毒病, 感染率高达 100%,致死率 10-50%。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术 为基础开发的专门检测犬细小病毒的试剂盒,它具有下列特点: 1. 即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板。
1. 即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化,灵敏性高。
3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4. 特异性高,引物是根据犬细小病毒高度保守区设计,不会跟其他病毒的 DNA 发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。
犬细小病毒探针法荧光定量PCR试剂盒规格及成分
编号 |
成分 |
规格 |
试剂一 |
2×Probe qPCR MagicMix |
500 μL(本色盖) |
试剂二 |
荧光 PCR 专用模板稀释液 |
1 mL(黄盖) |
试剂三 |
犬细小病毒探针法 qPCR 引物混合 液 |
100 μL(白盖) |
试剂四 |
犬细小病毒 qPCR 探针 |
50 μL(棕色管) |
试剂五 |
犬细小病毒探针法 qPCR 阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL) |
50 μL(黄盖) |
试剂六 |
使用手册 |
1 份 |
运输及保存 低温运输、-20℃保存,有效期一年。
自备试剂 DNA 模板、10×ROX(根据机型决定,具体见使用方法)。
使用方法 一、稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。 由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原, 本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,用带芯枪头, 下同)。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震 荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品,好设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性 对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼 容。
三、Probe qPCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用 水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。 10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加):
成分 |
样品管 N+2 个 |
PCR 阴性 对照管 |
标准曲线 样品管(2-7 管) |
2×Probe qPCR MagicMix |
10 μL |
10 μL |
各 10 μL |
犬细小病毒 qPCR 探针 |
1 μL |
1 μL |
各 1 μL |
犬细小病毒探针法 qPCR 引物混 合液 |
2 μL |
2 μL |
各 2 μL |
N+2 个待测 DNA 模板 |
7 μL |
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7 μL |
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第 7 步所得 PCR 超纯水阳性对照 稀释液(2-7 号) |
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各 7 μL(2 号样到 2 号管,3 号样到 3 号管…) |
11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR:
过程 |
温度 |
时间 |
预变性 |
95℃ |
3 min |
PCR 反应 (40 个循环) |
95℃ |
15sec |
60℃ |
1 min(采集 FAM 通道的荧光 信号 |
四、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。若重复结果 Ct 值 小于 40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。
荧光定量试剂对低丰度基因进行扩增定量时,较易出现无信号或者非特异性扩增,且Ct值常大于30。通过加大样本量或反应体系,亦无显著改观。其中一个重要的原因是目的基因浓度较低时,Taq酶不能有效结合到目的扩增区域,导致扩增失败。
荧光定量PCR试剂多年研发经验的基础上研发而成的定量试剂,该产品采用了抗体法热启动Taq酶。抗体与Taq酶紧密结合,在50℃反应30min条件下,仍然可以封闭95%以上的酶活,有效抑制了Taq酶结合到非目的扩增区域,限制了由于引物非特异性退火而导致的非特异性扩增。同时,配方添加了提升PCR反应扩增效率的因子,大大提升扩增效率,保证定量结果的可靠性,非常适合低浓度模板的扩增。
3.产品特点
★灵敏度高:可检测个位拷贝数的基因
★特异性高:有效避免非特异性扩增的出现
★稳定性高:复孔间差异小,实验结果重复性强
★扩增性能优:扩增效率高,荧光信号强
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!