黄曲霉探针法荧光定量PCR试剂盒

黄曲霉探针法荧光定量PCR试剂盒

Aspergillus flavus

产品及特点

黄曲霉(Aspergillus flavus.)，半知菌类，一种常见腐生真菌。多见于发霉 的粮食、粮制品及其它霉腐的有机物上。1993 年黄曲霉被世界卫生组织 （WHO)的癌症研究机构划定为 1 类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时，可导致肝癌甚至 死亡。在天然污染的食品中以黄曲霉 b1 最多见。其毒性和致癌性也强。 因此快速检测黄曲霉具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为 基础开发的专门检测黄曲霉的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据非洲马瘟病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒的 RNA 发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。

黄曲霉探针法荧光定量PCR试剂盒规格及成分

编号	成分	规格
试剂一	2×Probe qPCR MagicMix	500 μL（本色盖）
试剂二	荧光 PCR 专用模板稀释液	1 mL（黄盖）
试剂三	黄曲霉探针法 qPCR 引物混合 液	100 μL（白盖）
试剂四	黄曲霉 qPCR 探针	50 μL（棕色管）
试剂五	黄曲霉探针法 qPCR 阳性对照 2.0(1×10E8 拷贝/μL)	50 μL（黄盖）
试剂六	天净沙核酸释放剂（试用装）	20 次（1mL，绿盖）
试剂七	使用手册	1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。 

自备试剂 样品 DNA。

使用方法 一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液，用带芯枪 头，下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

7. 如果有 N 个样品，设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。

三、Probe qRT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用 水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加）： 

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性 对照管	标准曲线 样品管（2-7 管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各10 μL
黄曲霉探针法 qPCR 探针	1 μL	1 μL	各 2 μL
黄曲霉探针法 qPCR 引物混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 个待测 DNA 模板	6 μL
自备超纯水		6 μL
第 7 步所得标准曲线样品稀释液 （2-7 号）			各 6 μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程	温度	时间
预变性	94℃	5 min
qRT-PCR 反应 （40 个循环）	94℃	0.5 min
	55℃	0.5 min（采集 FAM 通道的荧光信号）
	72℃	0.5 min

五、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。


荧光定量试剂对低丰度基因进行扩增定量时，较易出现无信号或者非特异性扩增，且Ct值常大于30。通过加大样本量或反应体系，亦无显著改观。其中一个重要的原因是目的基因浓度较低时，Taq酶不能有效结合到目的扩增区域，导致扩增失败。
荧光定量PCR试剂多年研发经验的基础上研发而成的定量试剂，该产品采用了抗体法热启动Taq酶。抗体与Taq酶紧密结合，在50℃反应30min条件下，仍然可以封闭95%以上的酶活，有效抑制了Taq酶结合到非目的扩增区域，限制了由于引物非特异性退火而导致的非特异性扩增。同时，配方添加了提升PCR反应扩增效率的因子，大大提升扩增效率，保证定量结果的可靠性，非常适合低浓度模板的扩增。
3.产品特点
★灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
★特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
★稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
★扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
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