利什曼原虫通用PCR试剂盒

利什曼原虫通用PCR试剂盒

Leishmania spp.

产品及特点

利什曼原虫（Leishmania spp）泛指利什曼虫属的锥体虫科原虫，是一种 会引起利什曼病的寄生虫。利什曼原虫的主要宿主为脊椎动物，常见的感染对象 包括蹄兔目、啮齿目、犬科、和人类。目前全世界有 88 个国家报告过利什曼原 虫症的病例，感染人数达 1,200 万人。对人和哺乳动物致病的利什曼原虫有：引 起人体内脏利什曼病的为杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani），引起皮肤 利什曼病的为热带利什曼原虫（L．tropica）和墨西哥利什曼原虫（L．mexicana）， 引起粘膜皮肤利什曼病的为巴西利什曼原虫（L．araziliensis）等。我国的黑热 病是由杜氏利什曼原虫引起的。因此快速检测利什曼原虫具有重要意义。本产品 就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测利什曼原虫通用的试剂 盒，它具有下列特点：  

 

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据利什曼属原虫高度保守区设计，不会跟其他微生物的 DNA 发生交叉反应，但可以检测到上述的几种利什曼属原虫。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。 

利什曼原虫通用PCR试剂盒规格及成分

编号	成分	规格
试剂一	2×Probe qPCR MagicMix	0.5 mL（本色盖）
试剂二	荧光 PCR 专用模板稀释液	1 mL（黄盖）
试剂三	利什曼原虫通用探针法 qPCR 引物混合液	100 μL（白盖）
试剂四	利什曼原虫通用 qPCR 探针	50 μL（棕色管）
试剂五	利什曼原虫通用探针法 qPCR 阳性对照(1×10E8 拷贝/μL)	50 μL（黄盖）
试剂六	天净沙DNA释放剂试用装	20 次（1mL，绿盖）
试剂七	使用手册	1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。  

自备试剂 样品 DNA。
 

 

使用方法 一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本 产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，用带芯枪头， 下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7. 如果有 N 个样品，设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数真菌 DNA 提取试剂 盒兼容。也可以选购本公司的真菌 DNAout 或柱式真菌 DNAout。 

三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果进行定量分析，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做定 性分析，则 6 个标准曲线样品只选一个做（可以选 4 号，其余样品不变）。 以下只介绍定量分析的反应设置。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加）：

成分	N+2个 样品管	PCR阴性对照	标准曲线 样品管（2-7 管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
利什曼原虫通用 qPCR 探针	1 μL	1 μL	1 μL
利什曼原虫通用探针法 qPCR 引物混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 个待测样品 DNA 模板	6 μL	1	-
第 7 步所得标准曲线样品稀释液 （2-7 号）	-	-	各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR： 

过程	温度	时间
预变性	95℃	5 min
PCR反应 （35个循环）	95℃	15 sec
	60℃	1 min（采集 FAM 通道的荧光信号）

 

 

五、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值 为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。 

本试剂盒适用于各种 RNA制品的反转录反应以及随后的PCR扩增。它采用AMV进行反转录反应，能够获得更长的反转录产物。同时，在20ul反转录体系和50ul PCR反应体系中，还可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续的克隆实验。本试剂盒中配置的酶均为进口的酶。RT酶采用进口的AMV，所以cDNA更长，基因的信息保留得更完整！反转录过程中特异的RNase抑制剂可有效降低由于外源RNase污染而导致实验失败的风险。本试剂盒使用方便、快捷，可广泛用于cDNA克隆及目的基因检测等分子生物学实验。
注意：
1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。
2. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！