肉桂醇脱氢酶（CAD）活性检测试剂盒 紫外分光光度法

肉桂醇脱氢酶（CAD）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
货号：BC4170
规格：50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体60 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂一	粉剂×1瓶	-20℃保存
试剂二	液体×1瓶	2-8℃保存
试剂三	液体50 mL×1瓶	2-8℃保存

溶液的配制：

1. 提取液：内含不溶物，使用前摇匀。
2. 试剂一：临用前加入15 mL试剂三溶解。可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。
3. 试剂二：液体置于试剂瓶内玻璃管中。临用前加入15 mL乙醇充分混匀，配好后2-8℃保存。
4. 工作液的配制：将试剂一、试剂二、试剂三按1:1:2（V:V:V）的比例配制工作液，工作液现用现配。

产品说明：
CAD 是木质素生物合成途径中的关键酶之一，催化香豆醛、芥子醛以及松柏醛等生成与之相应的肉桂醇。该酶多存在于高等植物、酵母、菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。
CAD 催化肉桂醛和NADPH生成肉桂醇和NADP⁺，在340nm下测定NADPH消耗速率，即可反映CAD活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、乙醇和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心10min，取上清，置冰上待测。
2、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤

1. 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2. 操作表：在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂：

试剂名称	空白管	测定管
样本（µL）	-	100
蒸馏水（µL）	100	-
工作液（µL）	900	900
在1mL石英比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于25℃水浴5min，拿出迅速擦干测定5min10s时的吸光值A2，计算ΔA测定管= A1测定-A2测定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管（空白管只需做1-2次）。

三、CAD酶活计算

1. 按蛋白浓度计算

酶活定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
CAD酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样×Cpr）÷T=321.54×ΔA÷Cpr

1. 按样本质量计算

酶活定义：每g组织每分钟消耗1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
CAD酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T=321.54×ΔA÷W

1. 按细菌或细胞数量计算

酶活定义：每10⁴个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
CAD酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（500×V样÷V样总）÷T=0.643×ΔA
ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.001L；V样：反应体系中样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间，5min；500：细菌或细胞总数，500万；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
注意事项：
1、当A1小于0.8，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。
2、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.04。
实验实例：

1. 取约0.1g三叶草叶，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心10min，取上清，按照测定步骤操作，测定计算ΔA测定管= A1测定-A2测定=1.532-1.462=0.07，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.012-1.007=0.005，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.07-0.005=0.065，按样本质量计算得：CAD酶活（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W=209.001 U/g 质量。

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