土壤硝酸还原酶(S-NR)活性检测试剂盒 微量法

土壤硝酸还原酶（S-NR）活性检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC3105
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
试剂一	液体25 mL×1瓶	-20℃保存
试剂二	液体5 mL×1瓶	-20℃保存
试剂三	液体5 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂四	液体5 mL×1瓶	-20℃保存
试剂五	液体10 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂六	液体10 mL×1瓶	2-8℃保存
标准品	液体1 mL×1支	-20℃保存

溶液的配制：

1. 试剂五：如出现结晶析出，60℃水浴溶解后使用；
2. 标准品：10μmol/mL 亚硝 酸钠。

产品说明：
    S-NR催化土壤中硝酸盐还原为亚硝酸盐，是土壤硝态氮还原的关键酶。研究S-NR的活性对合理施肥，降低氮素的损失具有重要意义。
S-NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO₃ˉ +NADH+H^＋→ NO₂ˉ +NAD^＋+H₂O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨 基苯磺酸及 α -萘胺定量生成红色偶氮化合物；未反应的NADH会抑制后续的显色反应，用PMS将其中和后再进行后续反应；生成的红色偶氮化合物在 520 nm 有最大吸收峰，可用分光光度计/酶标仪测定。




注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、恒温培养箱/水浴锅、台式离心机、可调式移液器、30-50目筛、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料”附件
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

新鲜土样自然风干或37度烘箱风干，过30~50目筛。
二、测定步骤

1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至520nm，分光光度计用蒸馏水调零。
2. NaNO₂标准液的配制：用蒸馏水将标准品稀释1、0.8、0.6、0.4、0.2μmol/mL。
3. 标准品稀释表：

序号	稀释前浓度（µmol/mL）	标准液体积（µL）	蒸馏水体积（µL）	稀释后浓度（µmol/mL）
1	10	100	900	1
2	1	160	40	0.8
3	1	120	80	0.6
4	1	80	120	0.4
5	1	40	160	0.2

备注：实验中每个标准管需50µL标准溶液。

1. 样本测定：

试剂名称	1.5mLEP管
	测定管	对照管	标准管	空白管
风干土样（g）	0.05	0.05
NaNO2标准液（μL）			50
蒸馏水（μL）	50	50		50
试剂一（μL）	180	180	180	180
试剂二（μL）	18		18	18
混匀后，置于37℃水浴锅/恒温培养箱反应24h
试剂三（μL）	25	25	25	25
试剂二（μL）		18
立刻混匀， 8000rpm室温离心5min
上清液（μL）	80	80	80	80
试剂四（μL）	20	20	20	20
混匀后，置于37℃水浴锅/恒温培养箱保温20min
试剂五（μL）	50	50	50	50
试剂六（μL）	50	50	50	50

混匀，显色20min后，取200μL至微量玻璃比色皿/96孔板，520nm下读取各管吸光值，分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定- A对照，ΔA标准=A标准-A空白。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需检测1-2次。

注意事项：

1. 试剂一、试剂二和试剂四在冰上放置，用不完的试剂-20℃分装保存，避免反复冻融。
2. ΔA测定过小（小于0.01），可延长反应时间（37℃水浴时间）。
3. 当ΔA大于1时，可以将上清液用蒸馏水稀释后，再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。

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