Strep-tag II蛋白纯化磁珠

特别提示：包括Strep-tag II蛋白纯化磁珠在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：Strep-tag II蛋白纯化磁珠
英文名称：Strep-Tactin
产品货号：CZ008
产品规格：5ml/50ml/250ml

产品简介：
Strep-Tag系统是模拟链霉亲和素-生物素系统的新型蛋白纯化系统，Strep-Tactin 对Strep-Tag II的亲和能力与链霉亲和素相比，至少强10倍以上，且分离纯化条件温和，在生理条件下即可实现蛋白的分离纯化；此外，与其他tag相比，Strep-Tag II为8个氨基酸的小标签(WSHPQFEK)，由于标签小，仅为1 kDa左右，不影响融合后蛋白质的结构和功能。这些温和的纯化参数能保存蛋白质的生物活性，并仅经一步提取即可产出超过99%的纯度。Strep-Tactin 磁珠采用特殊的蛋白偶联工艺，将Strep-Tactin蛋白共价偶联到超顺磁性磁珠表面，制备了一种专为高效、快速分离纯化Strep-tag II蛋白的一种新型功能化材料，实现并搭建了提取速度、提取量及纯度兼得的蛋白纯化平台。
适用范围：
可用于从任何表达系统，包括杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母和细菌中含有Strep-Tag II标签蛋白的分离纯化。
操作流程：
目标蛋白与磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率，各种缓冲液配制也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。以下提供一个较为广泛应用的Strep-Tag II蛋白的纯化流程，用户可参考该操作流程，或者根据自己蛋白的特性自行设计和优化蛋白纯化流程。
1. 缓冲溶液配制
Binding/Washing Buffer：10 mM Tris-HCl,150 mM NaCl,1 mM EDTA,pH 8.0
Elution Buffer：2.5 mM desthiobiotin in Binding Buffer。
2. 样品处理
本说明书提供以下三种样品的处理方法：
(1) 大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：表达细胞用适量Binding Buffer稀释，加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM的PMSF)；冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶，在冰上放置30 min，以降解核酸。另外，如果目标蛋白含量较低，建议将粗蛋白样品进行离心操作。
(2) 胞外表达蛋白：取胞外表达上清，用等量Binding Buffer稀释平衡，即为粗蛋白样品。
(3) 动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量PBS洗涤1次，弃上清；用适量含1%(v/v) Triton X-100或1%(v/v)NP-40的Binding Buffer重悬；加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM的PMSF)；置于冰上10 min，即为粗蛋白样品。
3. 磁珠预处理
一般情况下，磁珠的使用量是由用户根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算获得。例如：采用大肠杆菌表达某目标蛋白，250 mL发酵液收获1 g湿重的菌体，通过预实验估算其目标蛋白产量为～7 mg，用户需要取10 mL 10%的磁珠悬液用于目标蛋白的纯化。以下即以此为例进行详细说明：
(1) 将磁珠产品置于漩涡混匀器上充分混匀，用移液器取10 mL磁珠悬液于离心管中；
(2) 将离心管置于磁性分离器上，待溶液变澄清后，移去上清液；
(3) 加入5～10 mL Binding Buffer/Washing Buffer到上述装有磁珠的离心管中，盖紧盖子，漩涡振荡15 s，使磁珠重新悬浮。将离心管置于磁性分离器上，磁性分离＊，移去上清液，重复洗涤2次。
(*注：在磁性分离过程中，为了减少磁珠在使用过程中的损耗，待溶液变澄清后，盖紧离心管盖子，保持离心管仍在磁性分离器上，手持磁性分离器与离心管上下翻转数次，使澄清的溶液涮洗离心管盖上残留的磁珠，静置片刻，使溶液重新变澄清；以下同。)
4.目标蛋白与磁珠结合
(1) 用10 mL Binding Buffer重悬1 g湿重的菌体，进行破碎和裂解后，即为粗蛋白样品；
(2) 将粗蛋白样品转移到装有已预处理磁珠的离心管中，盖紧离心管盖；
(3) 将离心管置于漩涡混匀器振荡15 s，然后将其置于垂直混合仪上，室温垂直混匀30 min(如果需要，可在2～8℃的低温环境下旋转混合约1 h，防止目标蛋白降解)；
(4) 将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液到新的离心管中以备后续检测。从磁性分离器上取下离心管进行下一步洗涤步骤。
5. 磁珠洗涤
(1) 将步骤4的磁珠中加入5～10 mL Washing Buffer，漩涡混合2 min，磁性分离，移出清洗液到新的离心管中，以备取样检测；
(2) 继续将上述磁珠中加入5～10 mL Washing Buffer，漩涡混合2 min，使磁珠重新悬浮，将磁珠悬液转移至新的离心管，避免原离心管壁上非特异性吸附蛋白污染目标蛋白；磁性分离，移出上清液到收集管，以备取样检测；
6.目标蛋白洗脱
(1) 加入2～5 mL Elution Buffer(用户可根据需要改变洗脱体积调整目标蛋白浓度)于离心管中，盖紧离心管盖，然后将离心管置于垂直混合仪上，室温垂直混合洗脱10 min；磁性分离，收集洗脱液到新的离心管中，即为纯化的目标蛋白样品；
(2) 如果需要，可以重复上述步骤1次，收集样品到新的离心管中，以检测目标蛋白是否洗脱完全。
7. 磁珠再生和保存
(1) NaOH再生：洗脱目的蛋白后的磁珠按照以下顺序进行洗涤： 5～10 mL纯化水洗涤3次、5～10 mL 0.5M NaOH 洗涤3次、5～10 mL纯化水洗涤至中性，zuì后加入10 mL保存液，将磁珠放置2～8℃环境保存。
(2) HABA再生：用脱硫生物素洗脱目标蛋白的磁珠还可以用HABA缓冲液再生，加入5～10 mL 1mM HABA洗涤磁珠5次，接着用Binding Buffer洗涤磁珠至磁珠本身颜色，每次洗涤5 min，zuì后加入10 mL 保存液，将磁珠放置2～8℃环境保存。
蛋白纯化流程的优化：
以上操作流程适用于大部分Strep-Tag II标签蛋白的纯化，根据目标蛋白与Strep-Tactin蛋白纯化磁珠的结合性能不同，用户可以从以下几个方面对纯化流程进行优化，以提高目标蛋白的回收率和纯度。
1. 提高目标蛋白回收率的参考方法：
(1) 延长蛋白溶液与磁珠孵育的时间；
(2) 添加合适的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解；
(3) 增加磁珠用量；
(4) 延长洗脱目标蛋白的时间或增加洗脱次数；
2. 提高目标蛋白纯度的参考方法：
(1) 在纯化过程中添加合适的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解；
(2) 延长洗涤的时间，增加洗涤次数；
注意事项：
(1) 首次使用本产品前，请务必详细阅读本用户手册；
(2) 磁珠使用和保存过程中应避免冷冻、干燥和高速离心等操作；
(3) 在使用本产品前，请务必充分振荡使磁珠保持均匀的悬浮状态；
(4) 请选用质量好的移液器吸头和离心管，以免磁珠贴壁或混合过程发生渗漏引起磁珠的损耗；
(5) 磁珠与溶液混合过程中，如果溶液粘稠无法通过翻转离心管重悬磁珠，可采用移液器反复吹吸或短时漩涡混合使磁珠充分重悬；
(6) 用户可根据实际需要保留经磁性分离移去的上清液，进行取样检测，以便分析纯化过程和优化蛋白纯化流程；
(7) 本产品可以重复使用，重复使用时，建议纯化同种蛋白，纯化不同种类的蛋白时，建议使用新的磁珠，以防交叉污染；
(8) 本产品需与磁性分离器配套使用；
(9) 本产品仅供研究使用。

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