标签抗体(Tag Antibody)
标签抗体,别名为抗原表位,又称抗原决定簇,是抗原分子中决定抗原特异性的特殊区域或基团,是与抗体特异性结合的结构或序列。随着生物技术的发展,科研人员可以通过DNA重组技术,构建包含目的基因以及表位标记的融合蛋白,进而通过特异性标签抗体对其鉴定与纯化,以达到研究的需求。
标签抗体(Tag Antibody)可用于检测和纯化各种商品化表达载体上的标签序列,籍以分析检目的蛋白的表达含量及其功能。其原理是抗原—抗体反应,这些标签抗体可以高度特异地结合对应的标签融合蛋白。
常用标签包括:Flag、Myc、HA、His、GST、MBP等。
Flag标签系统利用一个短的亲水性八氨基酸肽(DYKDDDDK)融合到目标蛋白;其纯化条件是非变性的,因此可以纯化所有有活性的融合蛋白。
Myc标签(序列为:EQKLISEEDL)已成功应用于WB杂交技术、免疫沉淀IP和流式细胞术中。因此可用于检测重组蛋白在细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳细胞中的表达情况。Myc重组蛋白质可通过偶联Myc标签抗体到二乙.烯砜活化的琼脂糖上而进行亲和纯化。但Myc重组蛋白的低pH洗脱条件往往会降低蛋白质的活力,因此Myc标签系统广泛应用于检测但很少用于纯化。
HA标签系统利用一个HA(influenza hemagglutintin epitope:YPYDVPDYA)短肽融合到目标蛋白。HA标签可位于蛋白质的C端或N端,该系统已广泛应用于多种细胞类型,相应的HA标签抗体也被广泛运用。
His标签是由6个组氨酸(His-His-His-His-His-His)组成的短肽,专门设计用于重组蛋白的吸附纯化。由于分子量小,且较容易分离和纯化,是目前使用最广泛的一种。
GST标签体系具有蛋白表达率高,表达产物纯化方便,利于GST抗体制备的特点。GST融合蛋白在水溶液中可溶,可从细菌裂解液中提取,在不变性的条件下通过亲和层析得到。
MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为40kDa,由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性,尤其是真核蛋白。如果蛋白在细菌中表达,MBP可以融合在蛋白的N端或C端。可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测MBP标签标记的重组蛋白。
华美生物标签抗体特别推荐:
Myc tag Monoclonal Antibody
货号:CSB-MA000041M0m
种属反应性:All
免疫原:EQKLISEEDL (Myc) synthetic peptide conjugate to KLH
应用范围:ELISA, WB, IF, IP
引用文献:The double-edged sword of endoplasmic reticulum stress in uremic sarcopenia through myogenesis perturbation , Jheng JR.et al,J Cachexia Sarcopenia Muscle,Jan 29
影响因子:12.511
内参抗体
内参即内部参照(Internal Control),对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。
在Western Blot实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,还需要进行内参的检测,以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。
此外使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。
常见的内参抗体:
1)GAPDH内参抗体
GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)是参与糖酵解的一种关键酶,由4个30-40kDa的亚基组成,分子量146kDa,检测条带大约在36kDa。 GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达,可广泛用作Western Blot蛋白质标准化的内参。
※不适合用于检测30kDa-40kDa大小目标蛋白的WB实验中。在某些细胞中,由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高,也不适合做内参。
2)β-Actin内参抗体
Actin即肌动蛋白,是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种,其中四种是不同肌肉组织特异性的,其余两种广泛分布于各种组织中,包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的,这是针对大多数组织和细胞来说的,它广泛分布于细胞浆内,表达量非常丰富,其含量占所有细胞总蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情况下,如脂肪组织或细胞内,β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成,分子量大小为42-43kDa左右。
※适合用于检测38kDa-48kDa大小目标蛋白的WB实验中。在脂肪组织里,β-Actin的表达量非常低,不适合作为内参。
3)β-Tubulin抗体
Tubulin即微管蛋白,是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin,其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体,是形成微管的最主要的两种Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分别为55kDa和50kDa,其实际检测条带均在55kDa左右。作为内参,β-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变,因此被广泛用于Western Blotting时上样量是否一致的参照,也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。
※不适合用于检测50kDa-60kDa大小目标蛋白的WB实验中。在脂肪组织或细胞内,β-Actin的表达量很少,不适合做内参。
Tips: 内参的选择还需考虑实际的实验环境:
★在做多组织多细胞样本对比表达量时,最好选用GAPDH作为内参,因为GAPDH是代谢类蛋白,在活组织中表达比较恒定。而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白,不同组织的细胞结构会有差异性。
★做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时,应选择结构蛋白作为内参,如β-Actin 和β-Tubulin。
★设计实验方案的时候应该考虑实际的实验因素并查询相应文献,在实验过程中也应该注意内参表达是否出现异常。
★做 Western Blot实验时,内参的条带强度也要适当控制。不要让内参条带发生过度曝光的情况,尤其是用 X 胶片曝光的。如果内参条带过度曝光,条带会显得很宽,妨碍对条带正确强度的判读,进而影响对其他实验结果的判断。最好.的内参结果是: 窄窄的,黑色实心条带。
华美生物内参抗体特别推荐:
GAPDH Monoclonal Antibody
货号:CSB-MA000071M0m
种属反应性:Human
免疫原:Recombinant Human GAPDH protein
应用范围:ELISA, WB, IHC, IP, IF, FC
引用文献:A fluorescence method for determination of glucose transport by intestinal BBMV of common carp , Yang LP,et al.Anal Biochem,Aug 26
客服QQ:2048334277 微信ID: Cusabio01 电话: 027-87939808
中文网站 http://www.cusabio.cn/ 英文网站 http://www.cusabio.com/
华美生物︱YOUR GOOD PARTNER IN BIOLOGY RESEARCH! |
武汉华美生物工程有限公司成立于2007年12月,是一家集科研、生产、销售为一体的生物高新技术企业。并形成了以CUSABIO为品牌的ELISA试剂盒、蛋白、抗体等多种优质产品,远销欧美日德等九十多个国家。 推荐您微信关注华美官方公众号,方便查询产品,同时获取生命科学更新资讯! |