标签/内参抗体

标签抗体（Tag Antibody）

标签抗体，别名为抗原表位，又称抗原决定簇，是抗原分子中决定抗原特异性的特殊区域或基团，是与抗体特异性结合的结构或序列。随着生物技术的发展，科研人员可以通过DNA重组技术，构建包含目的基因以及表位标记的融合蛋白，进而通过特异性标签抗体对其鉴定与纯化，以达到研究的需求。

标签抗体（Tag Antibody）可用于检测和纯化各种商品化表达载体上的标签序列，籍以分析检目的蛋白的表达含量及其功能。其原理是抗原—抗体反应，这些标签抗体可以高度特异地结合对应的标签融合蛋白。

常用标签包括：Flag、Myc、HA、His、GST、MBP等。

Flag标签系统利用一个短的亲水性八氨基酸肽（DYKDDDDK）融合到目标蛋白；其纯化条件是非变性的，因此可以纯化所有有活性的融合蛋白。

Myc标签（序列为：EQKLISEEDL）已成功应用于WB杂交技术、免疫沉淀IP和流式细胞术中。因此可用于检测重组蛋白在细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳细胞中的表达情况。Myc重组蛋白质可通过偶联Myc标签抗体到二乙.烯砜活化的琼脂糖上而进行亲和纯化。但Myc重组蛋白的低pH洗脱条件往往会降低蛋白质的活力，因此Myc标签系统广泛应用于检测但很少用于纯化。

HA标签系统利用一个HA（influenza hemagglutintin epitope:YPYDVPDYA）短肽融合到目标蛋白。HA标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统已广泛应用于多种细胞类型，相应的HA标签抗体也被广泛运用。

His标签是由6个组氨酸（His-His-His-His-His-His）组成的短肽，专门设计用于重组蛋白的吸附纯化。由于分子量小，且较容易分离和纯化，是目前使用最广泛的一种。

GST标签体系具有蛋白表达率高，表达产物纯化方便，利于GST抗体制备的特点。GST融合蛋白在水溶液中可溶，可从细菌裂解液中提取，在不变性的条件下通过亲和层析得到。

MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测MBP标签标记的重组蛋白。

华美生物标签抗体特别推荐：

Myc tag Monoclonal Antibody

货号：CSB-MA000041M0m

种属反应性：All

免疫原：EQKLISEEDL (Myc) synthetic peptide conjugate to KLH

应用范围：ELISA, WB, IF, IP

引用文献：The double-edged sword of endoplasmic reticulum stress in uremic sarcopenia through myogenesis perturbation , Jheng JR.et al,J Cachexia Sarcopenia Muscle,Jan 29

影响因子：12.511

 

内参抗体

内参即内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

在Western Blot实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

常见的内参抗体：

1）GAPDH内参抗体

GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。 GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，可广泛用作Western Blot蛋白质标准化的内参。

※不适合用于检测30kDa-40kDa大小目标蛋白的WB实验中。在某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，也不适合做内参。

2）β-Actin内参抗体

Actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，其余两种广泛分布于各种组织中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富，其含量占所有细胞总蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情况下，如脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成，分子量大小为42-43kDa左右。

※适合用于检测38kDa-48kDa大小目标蛋白的WB实验中。在脂肪组织里，β-Actin的表达量非常低，不适合作为内参。

3）β-Tubulin抗体

Tubulin即微管蛋白，是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin，其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体，是形成微管的最主要的两种Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分别为55kDa和50kDa，其实际检测条带均在55kDa左右。作为内参，β-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于Western Blotting时上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

※不适合用于检测50kDa-60kDa大小目标蛋白的WB实验中。在脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量很少，不适合做内参。

Tips: 内参的选择还需考虑实际的实验环境：

★在做多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用GAPDH作为内参，因为GAPDH是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定。而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性。

★做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，应选择结构蛋白作为内参，如β-Actin 和β-Tubulin。

★设计实验方案的时候应该考虑实际的实验因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意内参表达是否出现异常。

★做 Western Blot实验时，内参的条带强度也要适当控制。不要让内参条带发生过度曝光的情况，尤其是用 X 胶片曝光的。如果内参条带过度曝光，条带会显得很宽，妨碍对条带正确强度的判读，进而影响对其他实验结果的判断。最好.的内参结果是： 窄窄的，黑色实心条带。

华美生物内参抗体特别推荐：

GAPDH Monoclonal Antibody

货号：CSB-MA000071M0m

种属反应性：Human

免疫原：Recombinant Human GAPDH protein

应用范围：ELISA, WB, IHC, IP, IF, FC

引用文献：A fluorescence method for determination of glucose transport by intestinal BBMV of common carp , Yang LP,et al.Anal Biochem,Aug 26

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