生物素标记核酸检测试剂盒(化学发光法)

本试剂盒是一种通过Streptavidin-HRP及后续的ECL试剂来实现化学发光检测Biotin标记核酸的检测试剂盒。适用于Southern blot、Northern blot、ribonuclease protection assay (RPA)或EMSA等实验中，采用生物素标记的DNA或RNA探针时的检测。

本试剂盒可以用于检测至少10块10×10cm有生物素标记EMSA探针的膜，即共1000cm2。需要特别注意的是，本试剂盒并不适用于生物素标记蛋白的检测。

本试剂盒采用了高质量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共价交联的比例大于3，这样比采用Streptavidin和Biotin-HRP conjugate两种试剂进行检测要更方便，并且灵敏度更高。采用了非特异性结合比avidin更低的strepatavidin，使检测结果背景更低灵敏度更高。

本试剂盒没有提供生物素探针标记相关的试剂，生物素标记的DNA探针或EMSA探针的制备可以相应地使用我公司的生物素3"末端DNA标记试剂盒(YT030)或EMSA探针生物素标记试剂盒(YT189)。

产品组成：

组分	规格
BalbECL UT A液	55mL
BalbECL UT B液	55mL
Streptavidin-HRP Conjugate	100μL
封闭液	380mL
洗涤液(5X)	250mL
检测平衡液	250mL

储存条件：-20℃

注意事项：

• 需自备带正电荷尼龙膜，以及凝胶电泳时所需的相关试剂。带正电荷尼龙膜。


• BalbECL UT A液和B液均对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

使用方法：

• 在使用Biotin标记探针的情况下，完成Southern、Northern杂交及后续洗涤后，或RPA的转膜和交联后，或EMSA的转膜和交联后，可以使用本试剂盒开始检测。下面的检测过程中溶液的用量是用于一片10x10cm膜的量。如果膜较大或较小，各溶液的用量可以按比例放大或缩小。


• 37～50℃水浴溶解封闭液和洗涤液。
  注意：封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50℃之间使用，但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。


• 取一合适的容器加入15mL封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。


• 取7.5μL Streptavidin-HRP Conjugate加入到15mL封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。


• 去除封闭液，加入上一步中配制的15mL含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。


• 取25mL洗涤液(5X)，加入100mL重蒸水或Milli-Q级纯水，混匀配制成125mL洗涤液。


• 将尼龙膜转移至另一装有15～20mL洗涤液的容器内，漂洗1分钟。


• 去除洗涤液，加入15～20mL洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。


• 重复步骤8三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间均约为5分钟。


• 将尼龙膜转移至另一装有20～25mL检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。


• 取5mL BalbECL UT A液和5mL BalbECL UT B液混匀，配制成BalbECL UT工作液。
  注意：
  ① BalbECL UT工作液必须现配现用。
  ② 从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。


• 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。


• 在尼龙膜的表面小心加上步骤11配制好的共10mL BalbECL UT工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2～3分钟。


• 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒(也称片夹)内。


• 用X光片压片1～5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。

常见问题：

• 背景较高。
  • 可能是由于封闭液或洗涤液中出现沉淀或混浊。解决方法是参考使用说明，加热封闭液和洗涤液使封闭液和洗涤液完全溶解。


• 出现斑点状背景。
  • 可能是由于过长时间存放导致Streptavidin-HRP Conjugate中出现沉淀，解决方法是12000～14000g离心1分钟再吸取近液面的Streptavidin-HRP Conjugate。转膜时有气泡也会导致斑点状背景产生，解决方法是转膜时胶、膜、滤纸之间确保没有气泡。


• 没有条带或信号很弱。
  • 探针标记效率太低，解决方法是检测探针标记效率，确保探针的标记效率较高。
  
  
  • 探针用量不足或样品量不足，解决方法是加大探针用量或加大样品用量。
  
  
  • 样品中待检测的核酸降解，解决方法是检测待检测的核酸样品是否出现降解，如降解则须制备新的样品。
  
  
  • 转膜效果不佳，解决方法是检查转膜的方法和步骤，最好使用预染的标准品作为转膜的对照。
  
  
  • 选择了不适当的膜，尽管不少情况下硝酸纤维素膜也可以完成检测，请优先选择带正电荷的尼龙膜。
  
  
  • 检测过程中膜干掉了，解决方法是确保检测过程中膜可以被液体覆盖或始终保持湿润。
  
  
  • 没有交联或交联效果不佳，解决方法是进行适当的交联，如果交联效果不佳则须检测交联的效率。
  
  
  • 洗涤液(5X)没有稀释就直接使用，请把洗涤液(5X)稀释至1X后再使用。
  
  
  • X光片曝光时间不足，解决方法是适当延长曝光时间。