产品及特点
人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型(Human T-lymphotropic Virus 1 HTLV 1)是一种感染后可导致血癌或其他转移癌的 RNA 病毒,在体内主要感染 CD4+T淋巴细胞可引起成人 T 淋巴细胞白血病/淋巴瘤、HTLV 相关脊髓病(HTLV-Iassociated myelopathy , HAM/ 热带痉挛性下肢瘫, tropical spasticparaparesis TSP)及色素层炎(uveitis),主要通过输血、针头、性行为、母子传染。HTLV-I 病毒是爱滋病毒(HTLV-I) 的远亲,但 HTLV-I 和爱滋病的发生没有任何关连。目前各捐血中心以酵素免疫法全面筛检 HTLV-I 病毒。
本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型探针法荧光定量 RT-PCR 试剂盒,它具有下列特点:
1.即开即用,用户只需要提供样品 RNA 模板。
2.引物和探针经过优化,灵敏性高。
3.提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4.特异性高,引物是根据人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型高度保守区设计,不会跟其他病毒的 RNA 发生交叉反应。
5.本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。
6.本产品只能用于科研。
成分 |
编号 |
十孔盒包装 |
探针法 qRT-PCR 缓冲液 |
190504a |
500μL(蓝盖) |
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探针法 qRT-PCR 酶混合液 |
190504b |
100μL(红盖) |
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荧光 PCR 专用模板稀释液 |
180701 |
1 mL(黄盖) |
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人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型探针 |
15-87810yw |
100 μL(白盖) |
法 qRT-PCR 引物混合液 |
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人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型 |
15-87810pb |
50 μL(棕色管) |
qRT-PCR 探针 |
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人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型探针 |
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法 qRT-PCR 阳性对照 |
60908-87810pc |
50 μL(黄盖) |
(1×10E8 拷贝/μL) |
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使用手册 |
15-87810sc |
1 份 |
使用方法
一、稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。
由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1.标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
3.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 RNA 的制备
7.如果有 N 个样品,最好设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。
8.用自选方法纯化样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。
三、Probe qRT-PCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)
9.如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
成分 |
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阴性对照 |
样品管 |
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N+2 个 |
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管 |
(2-7 管) |
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探针法 qRT-PCR 缓冲液 |
各 10 μL |
10 μL |
各 10 μL |
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探针法 qRT-PCR 酶混合液 |
各 2 μL |
2 μL |
各 2 μL |
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人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型 qRT- |
各 1 μL |
1 μL |
各 1 μL |
PCR 探针 |
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人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型探针 |
各 2 μL |
2 μL |
各 2 μL |
法 qRT-PCR 引物混合液 |
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待测样品 RNA 模板 |
各 5 μL |
- |
- |
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超纯水 |
- |
5 μL |
- |
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各 5 μL(2 |
第 7 步所得标准曲线样品稀释液 |
- |
- |
号样到2号 |
(2-7 号) |
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管,3 号样到 |
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3 号管…) |
11.盖上盖子后上机,按下面参数进行 qRT-PCR:
过程 |
温度 |
时间 |
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逆转录 |
50℃ |
30 min |
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预变性 |
94℃ |
10 min |
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qRT-PCR 反应 |
94℃ |
15 sec |
(40 个循环) |
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60℃ |
1 min(采集 FAM 通道的荧光信号) |
五、数据处理
12.如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。
13.如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 35,则为阳性。 产品及特点
人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型(Human T-lymphotropic Virus 1 HTLV 1)是一种感染后可导致血癌或其他转移癌的 RNA 病毒,在体内主要感染 CD4+T淋巴细胞可引起成人 T 淋巴细胞白血病/淋巴瘤、HTLV 相关脊髓病(HTLV-Iassociated myelopathy , HAM/ 热带痉挛性下肢瘫, tropical spasticparaparesis TSP)及色素层炎(uveitis),主要通过输血、针头、性行为、母子传染。HTLV-I 病毒是爱滋病毒(HTLV-I) 的远亲,但 HTLV-I 和爱滋病的发生没有任何关连。目前各捐血中心以酵素免疫法全面筛检 HTLV-I 病毒。
本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型探针法荧光定量 RT-PCR 试剂盒,它具有下列特点:
1.即开即用,用户只需要提供样品 RNA 模板。
2.引物和探针经过优化,灵敏性高。
3.提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4.特异性高,引物是根据人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型高度保守区设计,不会跟其他病毒的 RNA 发生交叉反应。
5.本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。
6.本产品只能用于科研。
成分 |
编号 |
十孔盒包装 |
探针法 qRT-PCR 缓冲液 |
190504a |
500μL(蓝盖) |
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探针法 qRT-PCR 酶混合液 |
190504b |
100μL(红盖) |
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荧光 PCR 专用模板稀释液 |
180701 |
1 mL(黄盖) |
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人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型探针 |
15-87810yw |
100 μL(白盖) |
法 qRT-PCR 引物混合液 |
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人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型 |
15-87810pb |
50 μL(棕色管) |
qRT-PCR 探针 |
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人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型探针 |
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法 qRT-PCR 阳性对照 |
60908-87810pc |
50 μL(黄盖) |
(1×10E8 拷贝/μL) |
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使用手册 |
15-87810sc |
1 份 |
使用方法
一、稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。
由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1.标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
3.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 RNA 的制备
7.如果有 N 个样品,最好设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。
8.用自选方法纯化样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。
三、Probe qRT-PCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)
9.如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
成分 |
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阴性对照 |
样品管 |
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N+2 个 |
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管 |
(2-7 管) |
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探针法 qRT-PCR 缓冲液 |
各 10 μL |
10 μL |
各 10 μL |
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探针法 qRT-PCR 酶混合液 |
各 2 μL |
2 μL |
各 2 μL |
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人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型 qRT- |
各 1 μL |
1 μL |
各 1 μL |
PCR 探针 |
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人类嗜 T 淋巴细胞病毒 1 型探针 |
各 2 μL |
2 μL |
各 2 μL |
法 qRT-PCR 引物混合液 |
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待测样品 RNA 模板 |
各 5 μL |
- |
- |
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超纯水 |
- |
5 μL |
- |
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各 5 μL(2 |
第 7 步所得标准曲线样品稀释液 |
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号样到2号 |
(2-7 号) |
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管,3 号样到 |
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3 号管…) |
11.盖上盖子后上机,按下面参数进行 qRT-PCR: