EnGen 基因编辑突变检测试剂盒为检测基因编辑效率提供一整套的试剂。试剂盒操作的第一步,使用
Q5 热启动超保真聚合酶 2× 预混液从待测细胞中扩增出目的基因组的靶标区域(即通过 CRISPR/Cas9、
TALENs或 ZFN等方法进行了基因编辑的区域),经退火、延伸步骤后,形成异源双链 DNA。经过多轮循环后,基因插入和缺失(Indels)等造成的突变就将在扩增子池中得到富集。第二步,退火后的 PCR 产物用
EnGen T7 核酸内切酶 I 进行切割。 EnGen T7 核酸内切酶 I 是一种结构特异性酶,可有效识别大于1个碱基的基因错配。当出现错配时,DNA 分子的两条链被切割从而形成较小的片段。分析片段图谱可以对基因编辑实验的效率进行评估。
EnGen 基因编辑突变检测试剂盒包含一组对照模板和引物预混液,可用作PCR 反应及 T7 核酸内切酶 I 消化实验的对照。对照模板和引物预混液中含有2种对照质粒和1对对照引物。经 PCR 扩增、变性、退火,部分会形成含有10个碱基的插入突变,此种异源双链 DNA 正是 T7 核酸内切酶 I 的底物,600 bp 的
DNA 会被切割成 200 bp 和 400 bp 的两个片段;而同源双链 DNA 则不被 T7 核酸内切酶 I切割。通过琼脂糖凝胶电泳或片段分析设备可以非常方便的分辨出同源(野生型)和异源(突变)片段。
试剂盒的实验流程已经过优化,通过 Q5 热启动超保真聚合酶 2× 预混液扩增得到的 PCR 产物可以不经纯化而直接用 T7 核酸内切酶 I 进行消化。 异源双链DNA 分子只需 15 分钟就可以被完全切割,随后用蛋白酶 K 进行有效的反应终止。 此外, Q5 热启动超保真聚合酶 2× 预混液还可以用于在酶切之前优化靶点扩增实验 。
图1: 实验流程
将引物设计在已完成基因编辑位点的两侧,PCR 产物变性、退火后会生成三种结构。其中一种结构能够被 T7 核酸内切酶 I 切割(多于1个碱基错配的双链 DNA),经电泳分离和片段分析后,估算出基因编辑效率。
概述
EnGen 基因编辑突变检测试剂盒为检测基因编辑效率提供一整套的试剂。试剂盒操作的第一步,使用
Q5 热启动超保真聚合酶 2× 预混液从待测细胞中扩增出目的基因组的靶标区域(即通过 CRISPR/Cas9、
TALENs或 ZFN等方法进行了基因编辑的区域),经退火、延伸步骤后,形成异源双链 DNA。经过多轮循环后,基因插入和缺失(Indels)等造成的突变就将在扩增子池中得到富集。第二步,退火后的 PCR 产物用
EnGen T7 核酸内切酶 I 进行切割。 EnGen T7 核酸内切酶 I 是一种结构特异性酶,可有效识别大于1个碱基的基因错配。当出现错配时,DNA 分子的两条链被切割从而形成较小的片段。分析片段图谱可以对基因编辑实验的效率进行评估。
EnGen 基因编辑突变检测试剂盒包含一组对照模板和引物预混液,可用作PCR 反应及 T7 核酸内切酶 I 消化实验的对照。对照模板和引物预混液中含有2种对照质粒和1对对照引物。经 PCR 扩增、变性、退火,部分会形成含有10个碱基的插入突变,此种异源双链 DNA 正是 T7 核酸内切酶 I 的底物,600 bp 的
DNA 会被切割成 200 bp 和 400 bp 的两个片段;而同源双链 DNA 则不被 T7 核酸内切酶 I切割。通过琼脂糖凝胶电泳或片段分析设备可以非常方便的分辨出同源(野生型)和异源(突变)片段。
试剂盒的实验流程已经过优化,通过 Q5 热启动超保真聚合酶 2× 预混液扩增得到的 PCR 产物可以不经纯化而直接用 T7 核酸内切酶 I 进行消化。 异源双链DNA 分子只需 15 分钟就可以被完全切割,随后用蛋白酶 K 进行有效的反应终止。 此外, Q5 热启动超保真聚合酶 2× 预混液还可以用于在酶切之前优化靶点扩增实验 。
图1: 实验流程
将引物设计在已完成基因编辑位点的两侧,PCR 产物变性、退火后会生成三种结构。其中一种结构能够被 T7 核酸内切酶 I 切割(多于1个碱基错配的双链 DNA),经电泳分离和片段分析后,估算出基因编辑效率。
试剂盒组分
|
储存温度 (°C) |
浓度 |
Q5® 热启动超保真聚合酶 2×预混液 |
-20 |
2× |
NEBuffer 2 |
-20 |
10× |
EnGen™ T7 核酸内切酶 I |
|
|
对照模板及引物预混液 |
|
|
蛋白酶 K, 分子生物级 |
-20 |
4 mg/ml |
Quick-Load® 紫色 2-Log DNA Ladder (0.1 - 10.0 kb) |
4 |
|
凝胶上样缓冲液,紫色 (6X),不含 SDS |
25 |
6× |
特性和用途
所需材料(不提供)
PCR 寡聚核苷酸引物
PCR 管
无核苷酸水
PCR仪
带滤芯移液器吸头
储存温度
-20°C
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