第一链cDNA Synthesis Super Mix fo

特别提示：包括第一链cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(+gDNA wiper)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：第一链cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(+gDNA wiper)
英文名称：First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(+gDNA wiper)
产品货号：SY0292
产品规格：200T

本品基于Reverse Transcriptase ，该酶是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上经过多点突变得到的全新逆转录酶，热稳定性提高，在50℃下活性zuì高，且可耐受高达55℃的反应温度，适用于具有二级结构的RNA模板的逆转录，能稳定可靠地合成cDNA。

RNA模板首先用4×gDNA wiper Mix短暂处理，可彻底去除残留的基因组DNA污染，保证后续的定量结果更加可靠，并且可简化qPCR引物设计，无需跨外显子/内含子仔细设计；随后直接加入5×Super Mix II，即可立即进行逆转录。

5×Super Mix II中含有逆转录反应所需的所有组分 (Buffer、dNTP、Reverse Transcriptase、RNase inhibitor、Random primers/Oligo dT primer mix) ，并可同时终止4×gDNA wiper Mix，保证cDNA的完整性。RNA模板的体积zuì多可加到总体积的60%，非常适合于低浓度RNA模板的逆转录反应。4×gDNA wiper Mix和5×Super Mix II在-20℃不会冻结，使用方便。

该产品适用于两步法RT-qPCR检测，针对qPCR进行特别优化，比例优化的Random primers/Oligo dT primer mix，使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始，zuì大程度保证了qPCR结果的可重复性。逆转录产物兼容SYBR Green和探针法qPCR。

产品组份：
RNase free ddH2O————1 ml×2
4×gDNA wiper Mix————400 μl
5×Super Mix IIa————400 μl
5×Control Mixb————40 μl

a 包含Buffer、dNTP、Reverse Transcriptase、RNase inhibitor、Random primers/Oligo dT primer mix。
注：与First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(SY0291)中的5×Super Mix成分不同，不可以混用。
b 除不含Reverse Transcriptase外，其余成分与5×Super Mix II相同，用于配制对照反应。

质量控制

所有组分经检测均无核酸外切酶，核酸内切酶，RNase残留。
功能检测：以1 pg-1 μg HeLa cell total RNA为模板，测试qRT-PCR性能。以6个数量级的模板量的对数值对Ct值做标准曲线，R2>0.990，斜率在-3.20到-3.60之间；在1 μg HeLa cell total RNA中混入100 ng human genomic DNA，经gDNA wiper Mix处理后，进行qRT-PCR，对照反应的Ct值>40。

储存条件：-20℃。

除了第一链cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(+gDNA wiper),，我公司还供应以下相关产品：



名称：T3体外转录试剂盒
货号：BTN91108
规格：50次
本试剂盒是基于沙门氏噬菌体T3 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，它利用含有T3启动子的模版DNA，以NTP为底物，从T3启动子下游开始合成与模板DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。

产品特点：
1. 即开即用，用户只需提供含T3启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验，不需耍单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模板DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
4.可以合成的RNA的zuì佳长度在20nt到5000nt之问。
5.产品配方经过精心优化，每μg DNA模板可以合成2-6μg RNA。
6. 得到的RNA可以用于RNA结构研究、核解生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰(RNAi)等实验。

试剂盒组成：

成分	规格
转录预配液(2×)	0.5mL
阳性对照DNA(1.3 Kb片段)	20μL(10ng/μL)
T3 RNA聚合酶混合液	50μL
RNase-free水	1mL
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、制备DNA模板
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点：
1)必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
2)是需要转录的DNA序列的上游必须有T3启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T3启动子序列(5′AATTAACCCTCACTAAAGG 3′)加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T3启动子的载体，并且克隆位点必须位于T3启动子下游。
3)是需要转录的DNA序列的下游端zuì好不要是3′突出。如果是3′突出(如选择了Pst I来线性化质粒)，则zuì好用T4 DNA聚合酶修平。
4)是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，zuì好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。

二、体外转录反应
1.在一个RNase-free的塑料离心管中，在室温下(不是在4℃下)按次序加入下列成分：

成分	加入量	备注
DNA模板	xμl	总量在50 ng-1μg(如果模板是PCR片段，建议用50ng左右；如果模板是质粒DNA，建议用1μg左右；如果用本产品提供的阳性对照，建议用4μL)
转录预配液，2×	10μl	需室温时使用
T3 RNA聚合酶混合液	1μl	本成分还含其他促进剂，所以是混合物
RNase-free水	补水到20μL

注：此为20μL反应体系的用量，对其他体积的反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针，则需要定做NTP分开而不是NTP预先混合的试剂盒。如果需要得到加帽RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸(本公司有各种加帽修饰核苷酸)。
2. 37℃保温1-2小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热10分钟灭活T3 RNA聚合酶。
4. 取1-3μL电泳检测转录效果。一般1μg DNA可以合成 5-10μg的RNA。
5. 得到的RNA可以放-80℃保存。

若需进一步去除DNA模板，可参考下列操作步骤，但所用试剂需另行购买，本试剂盒不提供。
1.在体外转录结束后，在反应体系中加入3-5U自备的RNase-free DNase(BTN90903；3-5U/μL)。
2. 37℃保温15-30分钟。
3. 补水到100μL，
4. 用自备的等体积(100μL)的Tris饱和酚-lǜ仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
5.在上清中加200μL自备的微量核酸沉淀剂(BTN50903；用前需要摇晃混匀)，振荡后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
6. 加入1mL 75%乙醇，震荡10秒后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟，所得沉淀即去除DNA模板后的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。

疑难解答：
1、没有RNA产物。zuì常见原因是DNA模板有RNase污染，测试方法是用纯化的RNA跟模板DNA一起保温，再检测RNA是否降解。本试剂盒缓冲液和酶混合液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染严重，可能需要用户补加RNase inhibitor。
2、RNA产量低。zuì常见的原因是DNA模板序列。在转录序列的第一个和第二个碱基zuì好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。
3、RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有T3 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6或T7体外转录试剂盒(启动子也必须改成SP6或T7启动子)。
4、RNA长度比预计的长。T3 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，zuì多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是质粒DNA线性化不彻底。
5、5′单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长(如12小时)，则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T3 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5′端是单磷酸的比例将大大增加。