- ¥1000
- 钦诚生物
- 上海
- QC1139
- 2025年07月11日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
负20度
- 保质期：
2年
- 供应商：
钦诚生物
- 规格：
5ug
基本信息
| 原核抗性: | 氨苄青霉素Amp |
|---|---|
| 筛选标记: | 嘌呤霉素Puro |
| 克隆菌株: | 大肠杆菌DH5α |
| 培养条件: | LB培养基，37℃ |
| 备注: | 序列和Addgene有差异 |
质粒简介
pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin是一个哺乳细胞基因编辑质粒，U6启动sgRNA的转录，可用BsaI酶切连入sgRNA序列，pGK启动嘌呤霉素Puro抗性基因的表达。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 4951 bp ds-DNA circular SYN 17-七月-2017
KEYWORDS pGL3-U6-sgRNA-PGK-puro
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 4951)
AUTHORS
TITLE Direct Submission
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..4951
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
promoter 72..312
/label="U6 Promoter"
/note="U6 promoter"
/note="RNA polymerase III promoter for human U6 snRNA"
misc_RNA 343..418
/note="gRNA scaffold"
/note="guide RNA scaffold for the CRISPR/Cas9 system"
misc_feature 470..587
/note="cPPT/CTS"
/note="central polypurine tract and central termination
sequence of HIV-1"
promoter 636..1146
/note="hPGK promoter"
/note="human phosphoglycerate kinase 1 promoter"
CDS 1168..1767
/codon_start=1
/gene="pac from Streptomyces alboniger"
/product="puromycin N-acetyltransferase"
/note="PuroR"
/note="confers resistance to puromycin"
/translation="MTEYKPTVRLATRDDVPRAVRTLAAAFADYPATRHTVDPDRHIER
VTELQELFLTRVGLDIGKVWVADDGAAVAVWTTPESVEAGAVFAEIGPRMAELSGSRLA
AQQQMEGLLAPHRPKEPAWFLATVGVSPDHQGKGLGSAVVLPGVEAAERAGVPAFLETS
APRNLPFYERLGFTVTADVEVPEGPRTWCMTRKPGA"
polyA_signal 1914..2035
/note="SV40 poly(A) signal"
/note="SV40 polyadenylation signal"
rep_origin complement(2454..3042)
/direction=LEFT
/note="ori"
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
CDS complement(3213..4073)
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/note="AmpR"
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
/translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYI
ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
EPELNEAIPNDERDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
LIKHW"
promoter complement(4074..4178)
/gene="bla"
/note="AmpR promoter"
rep_origin 4205..4660
/direction=RIGHT
/note="f1 ori"
/note="f1 bacteriophage origin of replication; arrow
indicates direction of (+) strand synthesis"
polyA_signal 4791..4839
/note="synthetic polyadenylation signal"
misc_feature 4853..4944
/note="pause site"
/note="RNA polymerase II transcriptional pause signal from
the human alpha-2 globin gene"
ORIGIN
1 ggtaccgatt agtgaacgga tctcgacggt atcgatcacg agactagcct cgagcggccg
61 cccccttcac cgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg
121 ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata
181 cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa
241 tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct
301 tgtggaaagg acgaaacacc gtgagaccga gagagggtct cagttttaga gctagaaata
361 gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt
421 tttttaaaga attctcgacc tcgagacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa
481 aaggggggat tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca
541 tacaaactaa agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca
601 gggacagcag agatccactt tggccgcggc tcgagggggt tggggttgcg ccttttccaa
661 ggcagccctg ggtttgcgca gggacgcggc tgctctgggc gtggttccgg gaaacgcagc
721 ggcgccgacc ctgggactcg cacattcttc acgtccgttc gcagcgtcac ccggatcttc
781 gccgctaccc ttgtgggccc cccggcgacg cttcctgctc cgcccctaag tcgggaaggt
841 tccttgcggt tcgcggcgtg ccggacgtga caaacggaag ccgcacgtct cactagtacc
901 ctcgcagacg gacagcgcca gggagcaatg gcagcgcgcc gaccgcgatg ggctgtggcc
961 aatagcggct gctcagcagg gcgcgccgag agcagcggcc gggaaggggc ggtgcgggag
1021 gcggggtgtg gggcggtagt gtgggccctg ttcctgcccg cgcggtgttc cgcattctgc
1081 aagcctccgg agcgcacgtc ggcagtcggc tccctcgttg accgaatcac cgacctctct
1141 ccccaggggg atccaccgga gcttaccatg accgagtaca agcccacggt gcgcctcgcc
1201 acccgcgacg acgtccccag ggccgtacgc accctcgccg ccgcgttcgc cgactacccc
1261 gccacgcgcc acaccgtcga tccggaccgc cacatcgagc gggtcaccga gctgcaagaa
1321 ctcttcctca cgcgcgtcgg gctcgacatc ggcaaggtgt gggtcgcgga cgacggcgcc
1381 gcggtggcgg tctggaccac gccggagagc gtcgaagcgg gggcggtgtt cgccgagatc
1441 ggcccgcgca tggccgagtt gagcggttcc cggctggccg cgcagcaaca gatggaaggc
1501 ctcctggcgc cgcaccggcc caaggagccc gcgtggttcc tggccaccgt cggcgtctcg
1561 cccgaccacc agggcaaggg tctgggcagc gccgtcgtgc tccccggagt ggaggcggcc
1621 gagcgcgccg gggtgcccgc cttcctggaa acctccgcgc cccgcaacct ccccttctac
1681 gagcggctcg gcttcaccgt caccgccgac gtcgaggtgc ccgaaggacc gcgcacctgg
1741 tgcatgaccc gcaagcccgg tgcctgacgc ccgccccacg acccgcagcg cccgaccgaa
1801 aggagcgcac gaccccatgc atcggtacct ttaagaccaa tgacttacaa ggcagctgta
1861 gatcttagcc actttctaga gtcggggcgg ccggccgctt cgagcagaca tgataagata
1921 cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga
1981 aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttaacaa
2041 caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg ttttttaaag
2101 caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat cgataaggat ccgtcgaccg atgcccttga
2161 gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac
2221 ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctcttccgct
2281 tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac
2341 tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga
2401 gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat
2461 aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac
2521 ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct
2581 gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg
2641 ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg
2701 ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt
2761 cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg
2821 attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac
2881 ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga
2941 aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt
3001 gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt
3061 tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga
3121 ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc
3181 taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct
3241 atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata
3301 actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgggaccca
3361 cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga
3421 agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga
3481 gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg
3541 gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga
3601 gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt
3661 gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct
3721 cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca
3781 ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat
3841 accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga
3901 aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc
3961 aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg
4021 caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc
4081 ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt
4141 gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca
4201 cctgacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg
4261 accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc
4321 gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga
4381 tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt
4441 gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat
4501 agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat
4561 ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa
4621 tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt cccattcgcc attcaggctg
4681 cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gcccaagcta
4741 ccatgataag taagtaatat taaggtacgg gaggtacttg gagcggccgc aataaaatat
4801 ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtga atcgatagta ctaacatacg
4861 ctctccatca aaacaaaacg aaacaaaaca aactagcaaa ataggctgtc cccagtgcaa
4921 gtgcaggtgc cagaacattt ctctatcgat a
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文献和实验相关实验
的表达质粒。A）PCR 扩增的方法U6：来源于人 U6 小核启动子，常用小 RNA 表达，转录本为 shRNA。将 sgRNA 放到 U6 后面，利用 U6 的启动来扩增 sgRNA。将这部分内容整合到 Cas9 expression plasmid pSpCas9（Cas9 表达质粒）中，一起共转。B）sgRNA 表达质粒的方法现在我要用这个方法来举例设计 p53 引物找到包括 sgRNA 序列的前后 1000 个碱基的序列（2000 bp）找到的序列如下：将上面复制的序列粘贴到 blast 中
CRISPR-Cas9 全程实操教程：从 gRNA 设计到挑单克隆全程指导
的原件与表达 Cas9 的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行基因操作，在 PAM (5'-NGG) 上游～3bp 进行切割，如下图所示。因此本实验的关键步骤是设计一对 20bp（不包括 NGG 在内的）完全互补的 oligo 插入到如上图所示的 filler。另 U6 启动子需要 5' 端的 G 起始转录，因此若设计的 oligo 第一个碱基非 G，需额外增加一个 G。操作详细流程1. 设计 sgRNA关于 sgRNA 的设计我们有专门开过一篇文章《一文掌握
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pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puromycin哺乳编辑质粒
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