一步法荧光定量RT-PCR试剂盒（染料法)

特别提示：包括一步法荧光定量RT-PCR试剂盒（染料法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：一步法荧光定量RT-PCR试剂盒（染料法)
英文名称：Quant one step qRT-PCR Kit（SYBR Green)
产品货号：WH0101
产品规格：50μl×50次

本试剂盒是采用SYBR Green嵌合荧光法进行Real Time One Step RT-PCR的专用产品。使用本制品进行Real Time RT-PCR反应可在同一反应管内连续进行，操作简单，并能有效防止污染。本反应体系由于可以对扩增产物进行实时检测，大大提高了检测灵敏度，并省略了PCR反应后的电泳步骤，非常适合于微量RNA的检测。本试剂盒适用于一步法Real Time RT-PCR，可以准确简便地进行mRNA表达分析，适用于各种类型荧光定量PCR仪。

本试剂盒中使用了zuì适合于Real Time RT-PCR的反转录酶Quant RTase和Hotmaster Taq DNA polymerase。Quant Reverse Transcriptase是一种由工程菌进行重组表达的全新高效逆转录酶，具有与RNA高亲和性的特点，能通读GC含量高、二级结构复杂的RNA模板。Quant RTase是在Quant Reverse Transcriptase基础上进行修饰，使之更适合一步法Real Time PCR。Hotmaster Taq DNA Polymerase利用抑制剂通过温度调节方式封闭Hotmaster Taq DNA Polymerase的底物结合位点，温度低于40℃时，形成非活性的酶-抑制剂复合物，当温度升高至引物特异性的退火温度时，结合平衡向模板-特异性引物复合物形成方向移动，因此zuì大限度的减少PCR扩增全程中的非特异性扩增产物产生，大大提高了荧光定量PCR反应的精确性。

产品特点：
1．一步完成Real Time RT-qPCR反应，快速、准确地对RNA病毒等微量RNA进行分析。
2．PCR使用了改良后的HotMaster Taq Polymerase，可以进行Hot Start法PCR反应，再与专门开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。
3．2×Quant One Step RT-qPCR Mix （SYBR)中预先混有SYBR Green I和ROX Reference Dye等，无需花时间融解，反应液配制十分简单方便。
4．可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。

试剂盒组成：

组分	50μl×50次
2×Quant One Step RT-qPCR Mix （SYBR)*	1.3ml
HotMaster Taq Polymerase （2.5U/μl)	130μl
Quant RTase （for one step)	30 μl
RNase-Free ddH2O	2×1 ml

*内含dNTP Mixture，Mg2+，SYBR Green I和ROX Reference Dye等。
储存条件：-20℃避光保存

适用的Real Time PCR扩增仪：
ABI PRISM 7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast
Real-Time PCR System （Applied Biosystems)
OPTICONTM/CFX96 （BIORAD)
Light Cycler480 （Roche)
Smart Cycler?
System （Cepheid)
Mx3000 P/Mx3005P （Stratagene)
Line-Gene （Bioer，杭州博日)

注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1．当同时需要进行数次Real Time One Step RT-qPCR反应时，应先配制各种试剂的混合液（Master Mix；其中包括RNase-Free ddH2O、Buffer、各种酶等），然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。
2．使用HotMaster Taq Polymerase和Quant RTase时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有高浓度的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
3．保存2×Quant One Step RT-qPCR Mix （SYBR)或配制Real Time One Step RT-qPCR反应液时应避免强光照射。
4．反应液的配制、分装时请一定使用新的（无污染的）枪头或带滤心枪头、Microtube等，尽量避免污染。
5．制品只能使用特异性反转录引物，不能使用Random Primer和Oligo dT Primer等进行反转录反应。

操作步骤：
1．按下列组份配制50μl体系的RT-qPCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

成分	使用量	终浓度
2×Quant One Step RT-qPCR Mix （SYBR)	25 μl	1×
Hotmaster Taq Polymerase（2.5U/μl)	2.5 μl
Quant RTase （for one step)	0.4 μl
正向引物	-	0.2μM
反向引物	-	0.2μM
RNA模板	-
RNase-Free ddH2O	至50μl

  注意：
  ①通常引物终浓度为0.20μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1-1.0 μM范围内调整引物浓度。
  ②建议在反应液中使用10pg-100ng的Total RNA为模板。
2．进行Real Time One Step RT-qPCR反应。
  PCR反应管请用离心机瞬时离心后放入荧光定量PCR仪中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的标准PCR反应程序，如果使用该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。

循环	步骤	温度	时间	内容
1×	1	50℃	30min	反转录
1×	2	95℃	2min	起始模板变性
35-45×	3	94℃	20sec	PCR循环中模板变性
	4	50-60℃	20sec	退火
	5	68℃	20sec	延伸

3．实验结果分析。
  反应结束后确认Real Time One Step RT-qPCR的扩增曲线和熔解曲线，进行RT-PCR定量时制作标准曲线等。

除了一步法荧光定量RT-PCR试剂盒（染料法),，我公司还供应以下相关产品：
 

货号	名称	规格
WE0112	2×BaldStar Taq MasterMix(含染料)	5ml
WE0149	一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(低含量ROX校正染料)	100次
WE0159	dNTP混合溶液(10 mM)	1ml|5ml
SY0028	2×PCR Plus Master Mix(含染料)	5×1ml
SY0033	热启动DNA聚合酶	250U
SY0035	热启动PCR Master Mix(不含染料)	1ml×5
JN0025	UltraTaq DNA聚合酶	250U
QN0943	通用反转录试剂盒(不含Taq酶)	50T|100T
QN0961	通用引物 SP6	250μl(10uM)
QN0963	通用引物 T7	250μl(10uM)
HQF10	酵母免抽提直接PCR试剂盒	100次/500次/1000次
HQF13	转基因食品直接PCR试剂盒	100次/500次
CZ034	热启动Taq DNA聚合酶	250U/1000U