细胞/细菌总RNA提取试剂盒

特别提示：包括细胞/细菌总RNA提取试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：细胞/细菌总RNA提取试剂盒
英文名称：Total RNA Extraction Kit from Cultured Cells/Bacteria
产品货号：WH0060
产品规格：50次

本试剂盒采用高效、专一结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲系统，可从各种类型的培养细胞中快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。30-40分钟内即可完成反应，提取的总RNA纯度极高，没有蛋白质和其他污染。

产品特点：
·针对培养细胞和细菌独特配置，操作更简单、流程更优化。
·配有高效的DNaseⅠ，可有效去除DNA污染。
·配有CS过滤柱，可有效去除其它杂质。RNA纯度更高，无杂质残留，特别适合于对纯度要求很高的下游实验。
·操作安全可靠，无需酚/lǜ仿抽提，无需氯化铯梯度离心，无需氯化锂或乙醇沉淀。

下游应用：
· RT-PCR
· Northern blot、Dot blot
· Real-time RT-PCR
·芯片分析
· polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆

提取实例：


本试剂盒提取Human Jurkat Cells（1×10⁶)的总RNA。洗脱体积50μl，RNA上样量2～4μl，1%琼脂糖凝胶，6V/cm电泳30min。


本试剂盒提取大肠杆菌TOP10（1×10⁸)的总RNA。洗脱体积50μl，RNA上样量2～4μl，1%琼脂糖凝胶，6V/cm电泳30min。

试剂盒组成：

组分	50T
裂解液RL	30ml
去蛋白液RW1	40ml
漂洗液RW	12ml
RNase-Free ddH2O（瓶装)	15ml
RNase-Free吸附柱CR3（含2ml收集管)	50套
RNase-Free过滤柱CS（含2ml收集管)	50套
DNaseI	1500U
缓冲液RDD	4ml
RNase-Free ddH2O（管装)	1ml
RNase-Free离心管（1.5ml)	50个

储存条件：室温保存，RNase-Free DNase I,缓冲液RDD和RNase-Free ddH2O（管装)置于2-8℃保存；加入β-巯基乙醇的裂解液RL 4℃可放置一个月；

自备试剂：β-巯基乙醇、无水乙醇、溶菌酶（WH0218,细菌RNA提取可选）

预防RNase污染，应注意以下几方面：
1．经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2．使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3．RNA在裂解液RL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4．配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%（V/V)，放置过夜，高压灭菌。）

不同种细胞的zuì大用量及RNA得率：

细胞种类	zuì大用量	zuì大用量时RNA得率
COS	3×106	多至35μg
Hela	7×106	多至15μg
NIH/3T3	1×107	多至10μg

使用前注意事项：
1．操作前在RL中加入β-巯基乙醇至终浓度为1%，如1ml RL中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液zuì好现用现配。配好的RL 4℃可放置一个月，裂解液RL在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请加热溶解后使用。
2．第一次使用前应在漂洗液RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。
3．以下操作如非指明，均在室温下进行。

DNase I储存液的配制：
将DNase I干粉（1500U）溶解在550 μl RNase-Free ddH2O中，轻柔混匀，分装后-20℃贮存（可保存9个月）。
注意：从-20℃融化后的DNase I储存液保存于4℃（可保存6周），不要再次冻存。

操作步骤：

一、从培养细胞中提取总RNA
1．收集细胞：
  悬浮细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×10⁷）：估计细胞数量，300×g离心5 min，将细胞收集到离心管中，仔细吸除所有培养基上清。
  单层贴壁细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×10⁷）：可直接在培养容器中裂解（容器直径不超过10cm），或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。（在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法。）
  1）直接裂解法：确定细胞数量，彻底吸除细胞培养基上清，立即进行第2步裂解步骤。
  2）胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸除培养基，用PBS洗涤细胞，吸除PBS，向细胞中加入含有0.10-0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至RNase-Free的离心管中，300×g离心5 min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清。
  注意：收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，影响RNA与吸附柱的结合，造成RNA的产量降低。
2．裂解处理
  对于离心得到的细胞沉淀：轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加入适量裂解液RL（见下表，使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），旋涡震荡。

沉淀细胞数量	裂解液RL
＜5×106	350μl
5×106～1×107	600μl

  对于直接裂解的细胞：RL（见下表，使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），将细胞裂解液转移至离心管中，涡旋震荡混匀。

容器直径	裂解液RL
＜6cm	350μl
6～10cm	600μl

3．将所有溶液转移至过滤柱CS上（过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm（~13400×g)离心2 min，收集滤液。
4．向滤液中加入1倍体积70%乙醇（通常为350 μl或600 μl），混匀（此时可能会出现沉淀），得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中（吸附柱CR3放入收集管中），12,000rpm （~13400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
  注意：配制70%乙醇时请使用RNase-Free ddH2O，如果滤液体积有所损失，请相应减少70%乙醇用量。将溶液和沉淀转移至吸附柱CR3时，如果体积大于吸附柱容量，可以分两次完成。
5.向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
6．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μl RDD溶液，轻柔混匀。
7．向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15 min。
8．向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
9．向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
10．重复步骤9。
11．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR3在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
12．将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30-100 μl RNase-Free ddH2O室温放置2 min，12000rpm（~13400×g)离心2 min，得到RNA溶液。
  注意：洗脱缓冲液体积不应少于30 μl，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。

二、从细菌中提取总RNA
1．4℃12000rpm（~13400×g)离心2 min收集菌体（收集菌体的zuì大量不超过1×10⁹），仔细去除所有培养基上清，以后的所有离心步骤均在室温（20-25℃）进行。
  注：如果培养基上清去除不完全，将对第二步中的细胞壁消化过程产生抑制。
2．用含有溶菌酶的100 μl TE缓冲液（客户自己配制，配制方法见下表）彻底重悬菌体，孵育时间见下表。

	TE缓冲液中的溶菌酶终浓度	孵育时间（室温）
革兰氏阴性细菌	400μg/ml	3-5 min
革兰氏阳性细菌	3mg/ml	5-10min

3．加入350 μl裂解液RL（在使用前请加入β-巯基乙醇），涡旋振荡混匀，若出现不溶性沉淀，12000rpm（~13400×g)离心2 min，将上清转移至另一离心管中。
4．加入250 μl无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中（吸附柱放在收集管中），12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
5．向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
6．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μl RDD溶液，轻柔混匀。
7．向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15 min。
8．向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
9．向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇），室温放置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
10．重复步骤9。
11．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：此步骤目的是将吸附柱CR3中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT等实验。
12．将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-Free ddH2O，室温放置2 min，12000rpm（~13400×g)离心2 min，得到RNA溶液。
  注意：洗脱缓冲液体积不应少于30 μl，体积过小影响回收效率。RNA溶液请在-70℃保存。

除了细胞/细菌总RNA提取试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：
 

货号	名称	规格
BTN101121	软骨RNA柱式提取试剂盒	50次
BTN80804	柱式真菌RNA提取试剂盒	50次
BTN131231	Oligo(dT)纤维素	25mg
BTN130976	Oligo(dT)再生溶液	250mL
BTN3100	RNA长效保存液	1.5mL
WE0203	DNA/RNA提取试剂盒	50次
ALH017	细胞组织总RNA提取试剂盒(非TRIzol法)	20次|50次
ALH029	细菌RNA提取试剂盒(柱式吸附去除DNA)	20次|50次
ALH040	植物RNA大提试剂盒	10次
SY0273	水饱和酚	250ml
BTN180602	柱式病毒RNA提取试剂盒2.0	50次
QN2070	Trizol试剂	200ml|100ml
WH0049	血液总RNA提取试剂盒	50次
WH0050	通用型总RNA提取试剂（含指示剂)	100ml
WH0053	RNA纯化试剂盒	20次
WH0059	微量样本总RNA提取试剂盒	50次