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- xuanya
- 美国/中国
- XY-TE-0922
- 2025年12月10日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
两年
- 英文名：
AH109 Chemical Competent Cell
- 库存：
900
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
AH109 菌株来源于 PJ69-2A 酵母菌株，将 lacZ 报告基因引入 PJ69-2A 诞生了 AH109，此菌株是 Clontech 公司开发的 GAL4 系统酵母双杂实验用菌株，MATa 型，可 直接转化质粒或与 MATα型酵母菌株 Y187 通过 mating 操作进行蛋白互作验证或筛库试 验。Transformation marker 为: trp1, leu2，报告基因为：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1。 AH109-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。质粒 PGBKT7 的筛选标志为 TRP1，用于表达 DNA-BD(来自酵母转录因子 GAL4N 端 1~ 174 位氨基酸) 与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒 PGADT7 的筛选标志为 LEU，用于表达 AD(GAL4 C 端 768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白（Prey）的融合蛋白。
GAL4 系统原理：一个完整的酵母转录因子 GAL4 可分为功能上相互独立的两个结构 域：位于 N 端 1 ~ 174 位氨基酸区段的 DNA 结合域（DNA-BD）和位于 C 端 768 ~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD 能够识别 GAL4-responsive gene 的上游激活 序列 UAS，并与之结合。而 AD 可以启动 UAS 下游的基因进行转录。BD 和 AD 单独存在 不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的 GAL4 活性，使含有 UAS 的启动子下游基 因转录表达。正常条件下，BD 不与 AD 结合，将要检测的蛋白质分别与 BD 和 AD 融合， 形成 bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD），如果 bait 和 prey 发 生相互作用，就会促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的 GAL4，从而激活报告基因 的转录。AH109 有四个报告基因：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1，分别由三种不同的启动子 （GAL1，GAL2，MEL1）启动，这三种启动子只有 GAL4 识别的 17bp 核心区相同，其 余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。
本产品经特殊工艺制作而成，经PGADT7质粒检测转化效率为＞104 cfu/μg DNA。
菌株基因型如下：MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ,LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, MEL1 GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ
AH109酿酒酵母感受态细胞运输及保存：
感受态细胞干冰运输、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/LiAc 4℃保存；有效期半年。
自备试剂：目的 DNA、YPDA、 SD 培养基等
AH109酿酒酵母感受态细胞使用方法
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为 50-100 μL，可以根据 实际情况分装使用。 以下实验以 100 μL 感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中依次加入 2-5 μg 预冷的目的质粒、10μL Carrier DNA（95-100℃ 5 分钟，快速冰浴，重复一次）、500 μL PEG/LiAc， 吹打混匀，30℃水浴 30 分钟（15 分钟时翻转 6-8 次混匀）。
3. 42℃水浴 15 分钟（7.5 分钟时翻转 6-8 次混匀）。
4. 5000 rpm 离心 40 秒，弃上清。取 400 μL ddH2O 重悬沉淀，5000 rpm 离心 30 秒，弃上清。
5. 取 50 μL ddH2O 重悬沉淀，涂板，29℃培养 48-96 小时。
AH109酿酒酵母感受态细胞注意事项
1. 酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为 27-30℃；高于 31℃，生长速度和转化效率呈 指数下降。
2. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平 板上的 Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利 用，然而，有些菌株的 ADE2 基因被破坏，Adenine 合成途径受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中间产物 P - ribosylamino imidazole（AIR） 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
3. 酵母在缺陷培养基中生长速度比 YPDA 培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢， 以转化涂板为例：涂 YPDA 平板 29℃，48h 培养可见直径 1mm 克隆；涂 SD 单缺平 板 29℃，48-60h 培养可见直径 1mm 克隆，涂 SD 双缺平板 29℃，60-80h 培养可 见直径 1mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺平板 29℃，80-90h 培养可见直径 1mm 克隆。
4. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
5. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。
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文献和实验酿酒酵母感受态细胞的制备 （1）从YPD平板上挑取一个新鲜的酿酒酵母EBY100单克隆至10 ml YPD液体培养基，30℃，250 rpm 培养过夜。 （2）测定过夜培养物的OD600值为3.0~5.0之间。 （3）将10 ml YPD过夜培养物稀释至OD600值为0.2~0.4。 （4）在28~30℃摇床中继续培养3~6 hr，使其OD600值达到0.6~1.0。 （5）于室温1500 g 离心5 min 收集酵母细胞，弃上清。 （6）用10 ml 洗液洗酵母
Yeast Two-Hybrid Screening to Test for Protein–Protein Interactions in the Auditory System
We describe a protocol to screen for protein-protein interactions using the Gal-4 based yeast two-hybrid system. In this protocol, we describe serial transformation of bait into an already constructed cDNA library in yeast AH109 cells
的衍生物，不携带有些野生分离株含有的EcoRI或其它II型限制系统。 注意： 已证实，克隆实验中mcr 和mrr 位点可减少哺乳动物(8,9,11,14)和植物(9,15)甲基化序列的回收量。一般说来，从含有甲胞嘧啶有机体中克隆基因组DNA时，明智之举是使用无Mcr 和Mrr系统的菌种[如NEB 10-beta 感受态细胞(NEB #C3019)、NEB表达感受态细胞(NEB #C2523)或者T7 表达感受态细胞(NEB #C2566)]。这些有机体包括所有哺乳动物和高等植物，以及许多原核
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