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- xuanya
- 美国/中国
- XY-TE-0854
- 2025年12月10日
企业认证
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
两年
- 英文名：
Instant Blue-White C Vector
- 库存：
900
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
本产品是用Xcm I酶切环状的可保种型蓝白T载体(CAT#:60803)去掉一段1.3Kb的插入片段后得到的线性DNA片段(载体部分)，其两个末端的5’都有一个突出的T，可以用于快速克隆具有加尾活性的耐热酶(如Taq DNA聚合酶)扩增得到的PCR片段。
1. 由于是通过Xcm I酶切制备，所以载体两端的带T率为100%，远高于用Taq DNA聚合酶和TdT末端转移酶在平末端载体加尾得到的T载体。
2. 克隆的阳性率一般在90%以上, 缩短了筛选过程。
3. 插入位点两侧有对称的常见酶切位点（如EcoR I），便于对克隆的PCR片段进行近一步的分析。
4. 克隆位点两侧分别有T7和T3 RNA聚合酶启动子, 便于用克隆的PCR片段制备RNA探针。
5. 可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。
6. T克隆位点位于β-半乳糖苷酶的α-肽编码区内，可以进行蓝白斑筛选。
7. 含有丝状噬菌体f1 复制起始子，可以制备单链DNA
即用型蓝白T载体C型(T7-T3，无MCS)运输及保存：
低温运输，-20℃保存，有效期两年。
自备试剂：连接反应试剂，超纯水
即用型蓝白T载体C型(T7-T3，无MCS)使用方法
一. PCR产物的纯化和定量
1. 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离。最好不要使用TBE缓冲液，因为它会影响DNA的胶回收效率。
2. 在长波(360nm)紫外灯下快速切胶，尽可能切掉多余的凝胶。为避免嘧啶二聚体的形成，可以使用xuanya的DNA防护剂UV Erasol。
3. 用xuanya的柱式DNABACK纯化回收PCR片段。溶解PCR片段的超纯水体积越小越便于后续操作。
4. 将回收的片段与浓度已知的DNA Marker在含EB或绿如蓝染料的琼脂糖凝胶中电泳，通过比较DNA条带的荧光强度而估测PCR纯化产物的浓度。注意：一般不推荐使用测OD260的方法，因为回收的DNA很珍贵，该方法需要比较多的DNA。
5. 如果所得的DNA片段浓度较低，可以使用本公司核酸浓缩剂将其浓缩到需要的浓度。
6. 如果PCR片段为平末端，则需要用加A试剂盒处理，否则不能用于与T载体的连接反应。
即用型蓝白T载体C型(T7-T3，无MCS)二. 连接反应
1. 短暂离心装有T载体的离心管。
2. 在两个离心管中加入下列成分：
注: PCR纯化产物与蓝白T载体的摩尔比最好为3-10，可以按下面的公式计算出连接反应中需要的PCR 纯化产物的ng数:
假如插入片段和载体的连接比例设定为3，连接反应中加入蓝白T载体(长度为3 Kb)的量为40ng，则需要长度为0.5 Kb 的PCR 纯化产物的量是:
3. 用移液器吹打连接反应使之混匀后，16℃孵育12小时(或按T4 Ligase供货商提供的操作手册进行连接)。
即用型蓝白T载体C型(T7-T3，无MCS)三. 细菌转化
1. 将100 μL感受态细胞于冰上解冻。注意：最好使用转化效率在1×108 cfu/µg DNA以上的感受态细胞进行转化，因为采用单碱基突出端进行连接不是很有效。
2. 取5 μL连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。在冰上放置30分钟。
3. 将管放入预加温到42℃的水浴中，热休克90秒。快速将管转移到冰浴中，
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文献和实验Recombinant DNA Engineering, Or Cloning Genes In Plasmids
as those not carrying the plasmid will not survive antibiotics in culture medium. A region of the plasmid called multiple cloning site or MCS bears sites for various restriction enzymes to allow the insertion of a DNA of interest - the insert . Plasmids usually
PCR是极为重要的DNA增殖技术，应用层面非常广，其中包括了核酸探针的制备。如果一段DNA已经被次选殖至载体上，要以PCR扩增这段DNA时，可根据质体multiple cloning sites两边的序列，选用适当的核酸引子 （universal primers） 进行扩增反应；比较常用的引子包括SP6, T3 与T7 promoter primer, M13/pUCforward与reverse primers等；若有特殊考量，也可以使用序列专一性核酸引子对。进行PCR反应时若同时添加 [α
-FpBAD-RpBAD/HisABCpBAD-5' pBBR1MCST3/M13revT7/M13forpBD-GAL4pBD-GAL4-FPBD-GAL4-RpBI12135SNOSpBINDGAL4-BdforT3,EBVrevpBK-CMVM13F/T7M13R/T3pBluescriptIIKS(+/-)T3/M13revT7/M13for（优先用M13F）pBluescriptIISK(+/-)T3/M13revT7/M13forpBluescriptKS(+/-)T3/M13revT
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